Магистерская диссертация Горовика Ю. Н. Научный руководитель: к. б. н. Лагоненко А.Л.

Цель:
Изучить плазмидный состав бактерий E. аmylovora, выделенных на территории Беларуси, оценить их патогенность по отношению к различным видам растений семейства Rosaceae и вирулентность по отношению к растениям груши

Erwinia amylovora это грамм-отрицательная бактерия семейства Enterobacteriaceae. Возбудитель ожога плодовых у большинства видов растений подсемейства Maloideae семейства Rosaceae.

Плазмиды Erwinia amylovora
На сегодняшний день хорошо изучены пять плазмид Erwinia amylovora. pEU30, pEa34 и pEa8,7 обнаружены в американских штаммах, причем две последних несут гены устойчивости к стрептомицину. Плазмида pEL60 обнаруживается только в штаммах из Ливана. Самой распространенной является плазмида рЕА29. Ее широко используют для генетической дифференцировки штаммов Erwinia amylovora

Растения, поражаемые бактериями Erwinia amylovora
В целом, штаммы Erwinia amylovora не являются хозяевоспецифичными. К примеру, большинство штаммов, выделенных из растений яблони (Malus domestica) также патогенны для груши и других растений подсемейства Maloideae. Интересно, что штаммы Erwinia amylovora, выделенные из растений рода Rubus, не патогенны для груши и яблони. Штаммы, выделенные из азиатской груши (Хоккайдо, Япония), патогенны для Европейских сортов груши, но дифференциально патогенны по отношению к различным сортам яблони.

ПЦР-фрагменты, полученные после амплификации с pEA29-специфичными праймерами A/B. Дорожки: 1 – E. amylovora Ea1/79; 2 – LMG2024; 3 – Ea612; 4 – Ea646; 5 – Ea659; 6 – 133/95; 7 – EaL3-1; 8 – EaL3-2; 9 – EaL3-5; 10 – EaL3-6; 11 – EaL3-8; 12 – EaE1; 13 – EaE2; 14 – EaE3; 15 – EaE4; 16 – EaE5; 17 – EaL13; 18 – отрицательный контроль; M – маркерная ДНК

А. Анализ количества ssr в плазмиде pEA29 различных штаммов E. amylovora, на основании рестрикции Sau3A ПЦР фрагментов, полученных с помощью праймеров А и В. В. ПЦР фрагменты, полученные путем амплификации с праймерами RS1 и RS2c. Дорожки: 1 - Erwinia amylovora Ea1/79; 2 – LMG2024; 3 – Ea646; 4 – Ea659; 5 – 133/95; 6 – EaL3-2; 7 – EaL3-5; 8 – EaL13; 9 – EaE1; 10 – EaE2; 11 – EaE3; M – маркерная ДНК (стрелками указаны фрагменты ДНК, подвижность которых отличается)

А. Электрофореграмма продуктов рестрикции ферментом Sau3A ПЦР фрагментов, амплифицированных с праймерами А и В. 1 - Erwinia amylovora К2108; 2 - Ea1/79; 3 – ЕаЕ3. Б. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов плазмиды рЕА29 из различных штаммов Erwinia amylovora с праймерами RS1 и RS2c. 1 - Erwinia amylovora Ea1/79, 2 - ЕаL3-1, 3 - Ea646, 4 - K2108. M – маркерная ДНК

Симптомы бактериального ожога на листьях груши (А), боярышника (Б), айвы (В), малины (Г), ежевики (Д) и яблони (Е), проявляющиеся при искусственном заражении бактериями Erwinia amylovora (листья в левой части каждой фотографии – отрицательный контроль).

Определение спектра поражаемых видов растений, семейства Rosaceae
Примечание: «+» - развитие некроза листьев на шестые сутки после заражения;
«-» - отсутствие визуальных симптомов поражения листьев по сравнению с контролем.

Оценка вирулентности различных штаммов Erwinia amylovora, по отношению к растениям груши
Интенсивность развития бактериального ожога на отдельных листьях груши при заражении различными штаммами Erwinia amylovora.

Выводы:
Белорусские штаммы Erwinia amylovora, выделенные на территории Минской области содержат плазмиду рЕА29 с пятью восьминуклеотидными повторами, штамм К2108, изолированный в Гродненской области, содержит эту же плазмиду с количеством повторов более шести.
При искусственном заражении все исследованные штаммы Erwinia amylovora патогенны по отношению к растениям яблони, груши и айвы и не поражают иргу, хеномелес, рябину, землянику и аронию. Штаммы Еа1/79, LMG2024, EaE3, K2108 не вызывают некроз листьев боярышника, LMG2024 не поражает листья малины, а К2108 – листья ежевики.
Вирулентность штаммов Erwinia amylovora Еа1/79, Ea659, EaL3-5, EaE3, K2108 и EaL13 достоверно не различается. Штамм LMG2024 характеризуется самой низкой вирулентностью по отношению к растениям груши.