ОПЛОДОТВОРЕНИЕ

Оплодотворение – слияние сперматозоида с яйцеклеткой, завершающе-еся объединением их ядер в единое ядро оплодотворенного яйца (зиготы).
Готовность к оплодотворению определяется выделением направительных телец.
Особенности процесса оплодотворения:
Функции:
половая (комбинирование генов двух родителей) – передача генов от родителей потомкам;
репродуктивная (создание нового организма) – включает инициацию в цитоплазме яйца тех реакций, которые позволяют продолжать развитие.
Роль спермия:
активация яйца – побуждение яйцеклетки к началу развития;
внесение в яйцеклетку генетического материала отца .
Классификация:
по количеству сперматозоидов, участвующих в оплодотворении:
моноспермное – во внешней среде;
полиспермное – в половых путях самки.
по месту проникновения сперматозоида в яйцеклетку:
наружное – во внешней среде;
внесение – в половых путях самки.

Стадии (фазы) оплодотворения:
дистантные взаимодействия – осуществляются на некотором расстоянии, до соприкосновения гамет друг с другом;
контактные взаимодействия – начинаются с момента контакта сперматозоида с третичной оболочкой яйцеклетки;
проникновение спермия в яйцеклетку – в её основе лежит слияние плазматических мембран спермия и яйца;
слияние генетического материала – приводит к формированию диплоидного ядра зиготы.

Дистантные взаимодействия гамет:
Направлены на повышение вероятности встречи сперматозоидов и яйцеклетки.
Характерны для водных организмов, с наружным типом оплодотворения.
встреча спермиев и яиц при их низкой концентрации в среде;
предотвращение оплодотворения яиц спермиями другого вида.
Видоспецифичные привлечение спермиев и их активация (кишечнополостные, моллюски, иглокожие, первичнохордовые и т.п.)
Хемотаксис – движение по градиенту концентрации какого-либо вещества.
У морских ежей (пептиды студенистой оболочки яиц):
сперакт (10 а.к.)
резакт (14 а.к.)
Mov 1

Контактные взаимодействия гамет:
поступление Ca2+ в головку спермия
экзоцитоз акросомного пузырька (выброс протеолитических ферментов)
активация Na+/H+-обменника (защелачивание цитоплазмы)
полимеризация глобулярного актина (образование акросомного выроста)
активация динеиновой АТФ-азы (увеличение подвижности спермия)
повышение осмотического давления (способствует удлинению акросомального выроста)
1 – акросомная мембрана; 2 – плазматическая мембрана спермия; 3 – глобулярный актин; 4 – акросомные ферменты; 5 – актиновые микрофиламенты; 6 – акросомный вырост
Акросомная реакция спермия морского ежа
акросомная реакция

Контактные взаимодействия гамет:
Узнавание спермия и яйцеклетки
Морские ежи:
Видоспецифичное узнавание при помощи белка (биндина), расположенного на поверхности акросомного выроста.
На желточной оболочке яйца находится гликопротеиновый комплекс (рецептор), способный образовывать связи с биндином.
Локализация биндина на акросомном выросте (по Гилберту, 1993)
ДАБ – диамино-бензидин.

Капацитация (1):
Спермии млекопитающих после эякуляции не способны к акросомной реакции.
Капацитация – приобретение спермием оплодотворяющей способности
Половые пути самки принимают активное участие в процессе оплодотворения.
Суть процесса капацитации:
изменение структуры клеточной мембраны;
Снижение соотношения холестерин : фосфолипиды в мембране спермия (молекулы альбумина половых путей самки отнимают холестерин у спермия) – дестабилизация мембраны акросомного пузырька – возможность осуществления акросомной реакции.
удалении с поверхности спермия особых факторов
оставаясь на поверхности спермия “coating factors”препятствуют оплодотворению

Капацитация (2):
Поверхность спермия содержит гликозилтрансферазу (узнаёт концевые остатки N-ацетилглюкозамина на прозрачной оболочке яйцеклетки)
В спермиях, не прошедших капацитации, активные центры фермента блокированы остатками N-ацетилглюкозамина (NАг) и галактозы (Гал).
При капацитации углеводы отделяются от поверхности спермия, освобождая активные центры гликозилтрансфераз.
Гликтозилтрансферазы узнают N-ацетилглюкозаминовые остатки в молекуле гликопротеина, расположенного на поверхности прозрачной оболочки (рецептор спермия).
Схема узнавания спермием и яйцом друг друга у млекопитающих (схема капацитации)

Проникновение спермия у млекопитающих:
Блестящая оболочка яйцеклетки
– видоспецифичный барьер для связывания и проникновения спермиев собственного вида;
Абсолютной (100 %) защиты от проникновения спермия другого вида не даёт (e.g. лошадь + осёл = мул), однако удаление блестящей оболочки позволяет оплодотворять яйцеклетку спермиями другого вида.
Типы гликопротеинов (zona proteins, ZP):
ZP1 – сшивает белки ZP2 и ZP3, находясь перпендикулярно по отношению к ним;
ZP2 – расположен параллельно поверхности яйца. Взаимодействует с акрозином (протеолитический фермент акросомы), лизирующим блестящую оболочку;
ZP3 – расположен параллельно поверхности яйца. Необходим для взаимодействия с рецепторами спермия: терминальной галактозой, N-ацетилглюкозамином, гликопротеином плазматической мембраны.
Mov 2

У млекопитающих активация сперматозоида не сопровождается ни образованием микроворсинок, ни образованием акросомного выроста.
Проникновение спермия у млекопитающих:
Акросомная реакция у млекопитающих:
сперматозоид контактирует с яйцом не вершиной, а боком;
диссоциация наружной мембраны головки сперматозоида и мембраны акросомы (на поверхности, расположенной вдоль головки сперматозоида);
ферменты акросомы растворяют клетки лучистого венца;
сперматозоид вступает в контакт с блестящей оболочкой
Membrane cofactor protein (MCP; CD46) экспрессируется на внутренней мембране акросомы.

Проникновение спермия у млекопитающих:
A – экзоцитоз акросомы (иммунофлуорестенция и электронная микроскопия): а – интактная акросома, b – связывание спермия и блестящей оболочки, с – проникновение спермия через блестящую оболочку;
В – локализация протеасом у спермия, связанного с блестящей оболочкой яйцеклетки;
С – локализация протеасом у спермия, проходящего через блестящую оболочку.
PM – плазмалемма, IAM (OAM) – внутренняя (наружная) мембрана акросомы, АCMX – матрикс акросомы, содержащий протеасомы (зелёный цвет), ZPC – рецептор спермия (красный цвет, для части B), DNA – ДНК (синий цвет).
по: Sutovsky P. Reproduction. 2011. 142:1-14

Проникновение сперматозоида в яйцо:
Реакция активации сперматозоида заканчивается слипанием задней мембраны акросомы спермия и мембраны яйцеклетки, их разрывом и соединением свободных концов.
Формируется единая наружная мембрана, ограничивающая канал, через который ядро и проксимальная центриоль сперматозоида проникают в яйцо.
Контакт между сперматозоидом и яйцом вызывает полимеризацию актина и увеличение размеров микроворсинок яйца – формируется воспринимающий бугорок (гомологичен акросомному выросту).
Проникновение спермия в яйцеклетку хомячка (по Yanagimachi, R. and Noda, Y.D. 1970. Electron microscope studies of sperm incorporation into the hamster egg. American Journal of Anatomy 138:429-462).
Mov 3

Быстрый блок полиспермии:
Полиспермия (проникновение множества спермиев) приводит у большинства животных к гибельным последствиям.
Возникает триплоидное ядро (каждая хромосома представлена тремя копиями).
Полноценное распределение триплоидного набора между клетками невозможно.
Одни клетки получают лишние копии некоторых хромосом, тогда как у других эти хромосомы отсутствуют (атипичное развитие и гибель эмбриона).
Быстрый блок полиспермии (1 мин) достигает этой цели путем изменения электрического потенциала плазматической мембраны яйца.
Открытие ионных каналов в яйце индуцируется прикреплением к нему спермия.
Мембранный потенциал в яйце морского ежа до и после оплодотворения

Медленный блок полиспермии:
Кортикальная реакция – действует через 1 мин после прикрепления спермия.
В её основе Ca2+-зависимое слияние кортикальных гранул с плазмалеммой (выделение содержимого в область между плазмалеммой и желточной оболочкой
У млекопитающих кортикальная реакция не вызывает образования оболочки оплодотворения (реакция прозрачной оболочки или zona reaction)
Схема оплодотворения у морского ежа
(по Гилберту, 1993)
Mov 4
Mov 5
Mov 6

Медленный блок полиспермии:
вителлиновая деламиназа: отделяет желточную оболочку от цитоплазматической мембраны яйцеклетки; сперморецепторная гидролаза: освобождает поверхность яйца от осевших на желточной оболочке сперматозоидов, лизируя сайты их соединения;
мукополисахариды: создают осмотический градиент, обусловливающий поступление воды из цитоплазмы яйца в пространство между желточной оболочкой и плазматической мембраной (перивителлиновое пространство);
пероксидаза: вызывает затвердевание оболочки оплодотворения (образова-ние поперечных связей между остатками тирозина соседствующих белков);
гиалин: поддерживает бластомеры в период дробления.
Формирование оболочки
оплодотворения (по Гилберту, 1993):
1 – оболочка оплодотворения; 2 – гиалиновый слой

Механизм кортикальной реакции:
прикрепление спермия к рецептору плазматической мембране яйца
активация G-белка стимуляция активности фосфолипазы С – расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2) на диацилглицерол – DAG (связан с мембраной) и инозитолтрифосфат – IP3 (диффундирует в цитоплазму).
активация Na+/H+-антипортера (DAG, посредством протеинкиназы С) – усиление белкового синтеза, репликации ДНК, перемещения морфогенетических детерминант в цитоплазме.
высвобождение Ca2+ (из внутриклеточных депо) – посредством IP3 , что приводит к экзоцитозу кортикальных гранул (медленный блок полиспермии), а также активация НАД-киназы (синтез липидных компонентов мембраны de novo).
Mov 7

Слияние генетического материала (1):
Митохондрии спермия и жгутик разрушаются и в цитоплазме развивающихся взрослых организмов не обнаруживаются (митохондрии передаются от материнского организма, а центриоли от отцовского, хотя в яйцеклетках млекопитающих они изначально присутствуют в яйцеклетке).
Ядро яйца преобразуется в женский пронуклеус, а сперматическое ядро в мужской пронуклеус.
После проникновения в цитоплазму мужской пронуклеус поворачивается на 180о (центриоль спермия оказывается располагается между мужским и женским пронуклеусом). Ее микротрубочки удлиняются, вступая в контакт с женским пронуклеусом, после чего пронуклеусы перемещаются навстречу друг другу.
Mov 8

Слияние генетического материала (2):
У млекопитающих процесс сближения пронуклеусов продолжается около 12 часов (у морского ежа – всего 1 час).
Контакт пронуклеусов приходит к разрушению их ядерных оболочек, конденсации хроматина и образованию видимых хромосом (располагаются на общем митотическом веретене первого деления дробления ).
У млекопитающих истинно диплоидное ядро появляется у 2-х клеточного эмбриона.
Схема процесса оплодотворения у хомячка (по Гилберту, 1993):
А – спермий прикрепляется к яйцу; Б – прикрепление спермия к яйцу и взмахи его хвоста вызывают вращение яйца;
В – плазматические мембраны спермия и яйца сливаются;
Г – формируются пронуклеусы;
Д – начинается первое деление дробления; Е – двух клеточный зародыш