ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПО МЕТОДУ ЭДМАНА

ГЛУТАМИН
ПИРОГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА (pGlu, Glp)

АВТОМАТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ
ПО МЕТОДУ ЭДМАНА
П. ЭДМАН, Дж. БЭГГ, 1967 г.

СF3 – CF2 – CF2 – COOH
Гептафтормасляная кислота
Квадрол

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТВЕРДОФАЗНОГО СЕКВЕНАТОРА
Р.А. ЛАРСЕН, 1968 г.

ПРИНЦИП РАБОТЫ ГАЗОЖИДКОФАЗНОГО СЕКВЕНАТОРА
Л.ХУД, М.ХАНКЕПИЛЛЕР, 1981 г.
Диаметр диска 10 мм;
полибрен + белок
Объём реакционной камеры 50 мкл
Уровень чувствительности 100 пмоль
Продукты реакции

Реактор
Конвертор
Анализатор
Белково-пептидный секвенатор

t, мин
ХРОМАТОГРАММА СТАНДАРТНОЙ СМЕСИ ФТГ-АМИНОКИСЛОТ
ХРОМАТОГРАММЫ ПЕРВЫХ 4 ЦИКЛОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ЛАКТОГЛОБУЛИНА, 10 пмоль

Модификация дисульфидных групп цистина
а) восстановление дитиотреитолом, меркаптоэтанолом или другими тиолами;
б) окислительный сульфитолиз;
в) расщепление цианидами;
г) окисление надмуравьиной кислотой.

АНАЛИЗ РАСПОЛОЖЕНИЯ SH-ГРУПП И ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ
Титрование белка реактивом Эллмана -
5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой)
Дисульфидный обмен при pH>7,0
pH<7,0
Тионитробензойная кислота обладает сильным поглощением при
412 нм и определяется количественно спектрофотометрически.

Модификация сульфгидрильных групп цистеина
а) алкилирование иодуксусной кислотой или иодацетамидом;
б) аминоэтилирование этиленимином (не показана);
в) реакция с п-хлормеркуриобензойной кислотой;
г) окисление с помощью О2 до цистеиновой кислоты;
д) окисление с образованием дисульфидных связей в присутствии феррицианида;
е) реакция с азобензол-2-сульфенилбромидом;
ж) реакция с N-этилмалеимидом;
З) пиридилэтилирование 4-винилпиридином (не показана).

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
ИОНИЗАЦИЯ ОБРАЗЦА.
РАЗДЕЛЕНИЕ ОБРАЗОВАВШИХСЯ ИОНОВ В ЭЛЕКТРОМАГНИТНОМ ПОЛЕ В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ ОТНОШЕНИЯ МАССЫ К ЗАРЯДУ (m/z).
3. РЕГИСТРАЦИЯ МАСС-СПЕКТРА.

МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИИ
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) – матрично активированная лазерная десорбционная ионизация
ESI (ElectroSpray Ionization) – электрораспылительная ионизация при атмосферном давлении
EI (Electron Ionization) – электронная ионизация (ионизация электронным ударом)
CI (Chemical Ionization) – химическая ионизация в вакууме за счет столкновения с ионизированными газами CH4, (CH3)3CH, NH3 и др.
APCI (Atmosphere Pressure Chemical Ionization) – химическая ионизация при атмосферном давлении
PI (Photo Ionization) – фотоионизация в вакууме (ионизация за счет поглощения фотонов при облучении УФ-светом)
APPI (Atmosphere Pressure Photo Ionization) – фотоионизация при атмосферном давлении
FAB (Fast Atom Bombardment) – ионизация бомбардировкой ускоренными атомами Ar или Xe
DI (Desorption Ionization) – десорбционная ионизация продуктами распада радиоактивного изотопа калифорния 252Cf
DIOS (Desorption Ionization on Silicon) – десорбционная ионизация на силиконе (для малых молекул)
ESCI (ElectroSpray & Chemical Ionization) – комбинированная электрораспылительно-химическая ионизация

Nicotinic acid
Масс-спектрометрия MALDI: матрицы
Гентизиновая кислота, 337 нм Синапиновая кислота, 337 нм
Никотиновая кислота, 266 нм α−циано-4-гидрокси-транс-коричная кислота

Масс-спектрометрия МАЛДИ
Ионы могут разделяться в линейном режиме или с помощью рефлектрона (ионного зеркала), повышающего разрешающую способность прибора.

Масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией
Матиас МАНН, 1990 г.
Электростатическая дисперсия
5 kV
(ESI: Electro Spray Ionization)

ТАНДЕМНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ESI MS/MS
He
ДАС – диссоциация, активированная соударениями
(CIS – collision-induced dissociation)

Способы фрагментации пептидов
LID – фрагментация, индуцированная лазером
CID – фрагментация, индуцированная столкновениями
ECD – фрагментация, индуцированная захватом медленных электронов
Пептид поглощает энергию лазера, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь.
Может происходить отщепление модификаций.
Пептид приобретает энергию от столкновений, захваченная энергия перераспределяется по молекуле, разрушается ближайшая слабая связь.
Часто происходит отщепление модификаций.
Точный механизм неизвестен. Пептид захватывает медленные электроны на азот пептидной связи, происходит мгновенный разрыв пептидной цепи.
Не происходит отщепления модификаций.

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ
Ацилирование
N-концевой остаток
Lys
Фосфорилирование
Ser
Thr
Tyr
Гликозилирование
O-связывание (Ser, Thr, Tyr)
N-связывание (Asn, Arg)

Протеомика – наука, занимающаяся инвентаризацией белков в клетке
1975 г. – Патрик О’Фаррелл опубликовал методику двумерного электрофореза высокого разрешения для разделения сложных смесей белков
1982 г. – Лейф Андерсон предложил создать белковый атлас человека
1995 г. – Ян Хемпрли-Смит ввёл термин «протеом»
2001 г. - создана международная организация HUPO (Human Proteom Organization)

2D ПААГ
Смесь
пептидов
Идентификация белка
Извлечение из геля.
Солюбилизация.
Триптический гидролиз.
Сиквенс
пептида
Базы данных по
аминокислотным
последовательностям
М.м.
пептида
Базы данных по
молекулярным
массам
ВЭЖХ
ESI-MS/MS
Обработка данных
MALDI-MS
Обработка данных

2D электрофорез белков
Компьютерный анализ изображений гелей
Вырезание и трипсинолиз белков в фрагментах геля
Экстракция пептидов и получение
MALDI масс-спектра суммарного гидролизата
Поиск в базе данных измеренных масс пептидов
(пептидный фингерпринт)
Post Source Decay-MS, TOF-TOF
фрагментация отдельных пептидов
Поиск в базе данных измеренных масс фрагментов
Стратегия анализа: 2DE + MALDI-MS

Map Selection: E.coli
SWISS-2DPAGE: P00575
1 protein has been found

Количественная масс-спектрометрия с использованием технологии SWATH (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Fragments) - последовательной периодической регистрации всех теоретических фрагментов.
Принцип метода состоит в использовании широких (20-25 а.е.) последовательных окон пропускания квадруполем Q1 ионов-предшественников в ячейку столкновений и сохранением MS/MS спектров всех ионов-предшественников. Последовательные окна пропускания перекрывают в циклическом режиме весь диапазон значений m/z. Используя библиотеки тандемных MS/MS спектров предварительно идентифицированных пептидов и полученный с помощью SWATH технологии массив MS-данных можно оценить относительное количественное содержание любого пептида.
Conceived at Ruedi Aebersold’s lab, ETH Zürich
Implemented on SCIEX TripleToF™ systems

MS1 map
SWATH-MS principle: Acquisition & Targeted analysis
Aebersold and coworkers, ETH Zurich