ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ
Первичная Вторичная Третичная Четвертичная

Белки представляют собой высокомолекулярные биополимеры, построенные из аминокислотных остатков.
Практически все белки построены из 22 аминокислот.
Аминокислотные остатки соединены между собой амидной (пептидной) связью.
Полипептидная цепь имеет направление, которое определяется N- и C-концевыми остатками.

Аминокислотные остатки соединены между собой амидной (пептидной) связью
Полипептидная цепь имеет направление, которое определяется N- и C-концевыми остатками

ПРИМЕРЫ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ БЕЛКОВ
Lys: метилирование, ацетилирование
Arg: метилирование, дезаминирование
His: метилирование
Glu: карбоксилирование
Asp: образование сукцинимида
Cys: образование дисульфидной связи, пальмитоилирование
Ser: фосфорилирование, O-гликозилирование
Thr: фосфорилирование, O-гликозилирование
Tyr: фосфорилирование, сульфатирование, иодирование
Asn: дезамидирование, N-гликозилирование
Pro: гидроксилирование
N-концевой остаток: ацетилирование, формилирование,
образование пироглутамата, метилирование,
N-гликозилирование
C-концевой остаток: амидирование, О-метилирование,
убиквитинилирование, сумоилирование

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА (АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ N- И С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
ХИМИЧЕСКОЕ ИЛИ ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (СЕКВЕНИРОВАНИЕ)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
3. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ
4. УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Принцип
аминокислотного
анализа
Гидролиз в 5,7н HCl
при 1100C в вакууме
в течение 24-96 часов

ФЕНИЛИЗОТИОЦИАНАТ
(ФИТЦ, PITC)
НИНГИДРИН (ТРИКЕТОГИДРИНДЕНГИДРАТ)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
1. МЕТОД Ф.СЕНГЕРА (1945 г.)

2. ДАНСИЛЬНЫЙ МЕТОД (В.Р.ГРЕЙ, Б.С.ХАРТЛИ, 1963 г.)

3. МЕТОД ЭДМАНА (1956 г.)
ФЕНИЛИЗОТИОЦИАНАТ
(ФИТЦ, PITC,
РЕАГЕНТ ЭДМАНА)

4. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ АМИНОПЕПТИДАЗАМИ
ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗА (С НАИБОЛЬШЕЙ СКОРОСТЬЮ ГИДРОЛИЗУЕТ СВЯЗИ Leu, Ile, Val)
АМИНОПЕПТИДАЗА М (ГИДРОЛИЗУЕТ ВСЕ СВЯЗИ, КРОМЕ Pro-X и X-Pro)
ДИПЕПТИДИЛАМИНОПЕПТИДАЗА I ИЛИ КАТЕПСИН С (ОТЩЕПЛЯЕТ N-КОНЦЕВОЙ ДИПЕПТИД)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ
АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
МЕТОД ГИДРАЗИНОЛИЗА (Сиро АКАБОРИ, 1952 г.)
Безводный NH2-NH2, 1200C, 10 час

2. ОКСАЗОЛОНОВЫЙ МЕТОД
ПО МАТСУО ИЛИ МЕТОД ТРИТИЕВОЙ МЕТКИ
(Hisayuki MATSUO, 1965 г.)

3. С-КОНЦЕВОЕ
АВТОМАТИЧЕСКОЕ
СЕКВЕНИРОВАНИЕ.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
С-КОНЦЕВЫХ ОСТАТКОВ В ВИДЕ ТИОГИДАНТОИНОВ

4. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ КАРБОКСИПЕПТИДАЗАМИ

ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ
1. Расщепление по остаткам Met (Эрхард ГРОСС, Бернард ВИТКОП, 1962 г.)

2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ОСТАТКУ Trp ПО МЕТОДУ А. ФОНТАНА
(1970 г.)

2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол
(скатол = 3-метилиндол)

3. РАСЩЕПЛЕНИЕ СВЯЗИ Asn-Gly

2-иминотиозолидинкарбоновая кислота
5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ОСТАТКАМ Cys
(А. ПАТЧОРНИК, 1974 г.)
2-нитро-5-тиоцианатбензойная кислота

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ФРАГМЕНТАЦИИ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
ВЫСОКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
1. Трипсин pH 7,0-9,0
Lys—X Arg—X Lys—Pro Arg—Pro
Протеаза из St. aureus
рН 4,0 рН 7,8
Glu—X Asp—Leu
Y—Pro
3. Лизин-специфическая протеаза
pH 8,0 X—Lys
4. Клострипаин
pH 7,7 Arg—X Lys—X
5. Тромбин рН 8,0
Arg—X
X=Gly, Ala, Val, Arg, Asp, His, Cys
6. Протеаза из подчелюстной железы мышей рН 7,5-8,0
Arg—X Arg—Val Arg—Arg
Протеаза из почек ягненка
pH 7,5-8,0 Pro—X Pro—Pro
НИЗКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
1. Химотрипсин pH 7,8-9,0
Tyr—X Phe—X Trp—X
Leu—X Met—X His—X с меньшей скоростью;
X—Pro
Термолизин рН 7,0-9,0
X—Ile X—Leu X—Val
X—Phe X—Tyr X—Trp
X—Ala X—Met
X—Y—Pro
Пепсин pH 2,0
связи ароматических и объемных алифатических аминокислот, Glu
Папаин pH 5,0-7,5
широкая специфичность
5. Эластаза рН 7,0-9,0
Ser—X Gly—X
Ala—X Val—X Leu—X

ХИМОТРИПСИН
ТЕРМОЛИЗИН
pH 7,8 – 9,0
С МЕНЬШЕЙ СКОРОСТЬЮ
pH 7,0 – 9,0
С МЕНЬШЕЙ СКОРОСТЬЮ

ЛИЗИН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ
ПРОТЕАЗА ИЗ Armillaria mellea
pH 8,0
ЭНДОПРОТЕИНАЗА Lys-C ИЗ
Lysobacter ensymogenes
КЛОСТРИПАИН
ИЗ Clostridium histolyticum
pH 7,7
pH 7,7
ЭНДОПРОТЕИНАЗА Arg-C ИЗ
подчелюстной железы мыши
pH 7,5 – 8,0