РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ СОРТАХ ЗЕЛЕНОГО И

Важнейшие биологически активные компоненты чая
1

Методы анализа реальных объектов, содержащих полифенольные соединения
Определение общего содержания полифенолов
УФ
Анализ катехинов, алкалоидов
ЭХ
Анализ полифенолов, аминокислот, сахаров, витаминов, органических кислот
МС
Анализ теафлавинов гликозидов, витаминов
Фл
Анализ полифенолов в биологических жидкостях человека
КАПИЛЛЯРНЫЙ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ
2

J. of Chromatogr. А, Talanta, Analytica Chimica Acta. 2005-2006 гг
Всего: 17 статей
3

4
МЕТОД КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Поставленные задачи:
Получение спектрофотометрических характеристик полифенолов и кофеина
Оптимизация условий разделения модельной смеси полифенолов в режиме капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ)
Выяснение возможностей мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для одновременного разделения полифенолов и кофеина. Установление факторов, влияющих на селективность и эффективность разделения в этом режиме
Количественный анализ реальных объектов и получение характеристических профилей
Использование метода ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием как референтного для решения этой задачи
5

Оптимизация условий детектирования
В качестве рабочей была выбрана длина волны детектирования 200 нм
6
Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700;
длина оптического пути = 1 см;
концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – 2∙10-5 М

Электрофореграмма модельной смеси катехинов в КЗЭ
КАПЕЛЬ 105, Капилляр: Lобщ = 60 см, Lэфф =50 см, dвнутр=75 мкм.
Длина волны: λ = 200 нм
Буферный электролит:
12,5 мМ тетрабората натрия (pH 9.2), 8 мМ β-циклодекстрина
Проба: Cat, EC – по 10 мг/л,
EGC, ECG, GCG, EGCG – по 20 мг/л
Ввод: 30 мбар, 10 сек
Напряжение: 20 кВ
7
pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26

Вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии
N –компоненты пробы, взаимодействующие с мицеллами
Мицеллы и ЭОП движутся в противоположных направлениях.
Компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллярной фазой, при этом константа распределения специфична для каждого сорта молекул пробы.
C12H25OSO3- Na+
Додецилсульфат натрия
ККМ = 8,3 мМ
8

Зависимость электрофоретических подвижностей аналитов от концентрации детергента в буферном электролите
где Lобщ – общая длина капилляра, см
Lэфф – эффективная длина капилляра, см
U – величина рабочего напряжения, В
tмигр – время миграции компонента, с
9

Зависимость коэффициента разрешения от концентрации детергента в буферном электролите
где t1и t2 – времена миграции первого и второго компонента,
соответственно, мин
w10,5 и w20,5 – ширина пиков на полувысоте, мин
10

Зависимость эффективности разделения от концентрации детергента в буферном электролите
11
где tR – времена миграции аналита, соответственно, мин
W0,5 – ширина пика аналита на полувысоте, мин

Электрофореграмма модельной смеси катехинов, галловой кислоты и кофеина в МЭКХ
Ведущий электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7,0, 25 мМ додецилсульфата натрия
Проба: смесь стандартов:C, EC – по 25мг/л, Caf – 12,5 мг/л, EGC, ECG, GCG, EGCG, GA – по 50 мг/л
Ввод: 30 мбар, 10 сек. Напряжение: 25 кВ. Длина волны: λ = 200 нм
12

Характеристические профили образцов чая
1 – Caf,
2 – EGC,
3 – EGCG,
4 – EC,
5 – GA,
6 – ECG
13
Экстракт зеленого чая
Экстракт белого чая
Экстракт черного чая
45 mAU
45 mAU
45 mAU

14
ПО 1 мкг/мл
P = 0.95, n = 5
Количественный анализ
различных сортов чая

15
Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями

16
Изменение концентрации свободной формы EGCG от мольного соотношения белок/полифенол

1
2
3
1 – казеин (5 мг/л)
2 – EGCG (3 мг/л)
3 – модельная смесь EGCG (3 мг/л) и
казеина (20 мг/л)
17
Электронные спектры поглощения
эпигаллокатехин галлата, казеина и их комплекса
Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700;
длина оптического пути = 1 см;
концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – 2∙10-5 М

18
5 % молока
5 % молока
Зеленый чай
Черный чай
Влияние добавки молока в чай на его электрофоретический профиль
1 – Caf, 2 – EGC, 3 – EGCG, 4 – EC, 5 – GA, 6 – ECG

19
Влияние добавки в чай молока на
содержание полифенолов
P = 0.95, n = 5

20
Изменение электрофоретического профиля чая при добавлении соли железа (III)

21
Изменение площади пика EGCG на электрофореграмме при добавлении в пробу соли железа (III)

Зависимость Rf аналитов от концентрации метанола в составе подвижной фазе
22
Rf = a/b
Rh = Rf ·100
Пластины «Sorbfil» ПТСХ-АФ-В-УФ
(ООО «Имид», г. Краснодар)
П.ф. метанол - этилацетат
ПО (Caf) 100 нг

23
Влияние состава элюента на селективность разделение кофеина и эпикатехина
При содержании метанола 10%
Rf (Caf) = 0,17
Оптимальный состав элюента:
метанол – этилацетат = 25 : 75 % об.

(1 – 7) – стандартные растворы кофеина,
8 – проба чая,
9 – проба чая с добавкой хлорида железа (III)
Влияние добавки соли железа (III) на хроматографический профиль реального объекта
24
Условия:Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил»,
п.ф. - CH3OH : CH3COOC2H5 = 1 : 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Линия фронта растворителя
Линия старта

Колонка: Supelco C18; 150 ×4 мм
Элюент: ацетонитрил – 1 % муравьиная кислота
25
Проверка корректности результатов количественного определения полифенолов и кофеина, полученных в режиме КЭ

Варианты изократического и градиентного элюирования в режиме ОФ ВЭЖХ
26
Элюент А – ацетонитрил
Элюент В – 1% муравьиная кислота

Оптимальные условия разделения модельной смеси кофеина и полифенолов в режиме ВЭЖХ
Линейный градиент элюирования:
0.0 мин – 15% элюента А
15.0 мин – 5 % элюента А
Элюент А – CH3CN
Элюент В – 1% HCOOH
27
Колонка: Supelco С18; 150 x 4 мм
Детектирование: 254 нм
ПО (Caf, GA) 1 мкг/мл
ПО (EGC,EGCG) 10 мкг/мл

28
Caf
GA
EGCG
(P = 0.95, n = 3)
Использование метода ВЭЖХ в качестве референтного

Сопоставление с литературными данными
29
Концентрация выражена в % масс
[1] P.L. Fernandez, M.J. Martin, etc. The Analyst. 2000. V. 125. P.421-425.
[2] B.-L. Lee, C.-N. Ong. J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P.439-447.

Выводы
1. Изучены возможности различных вариантов капиллярного электрофореза с УФ-детектированием (КЗЭ и МЭКХ) для одновременного разделения смеси полифенолов и кофеина. Показано, что использование мицеллярного режима позволяет проводить их количественное определение с пределом обнаружения 1 мкг/мл. В качестве референтного использовался метод ОФ ВЭЖХ
2. Установлены зависимости электрофоретических подвижностей, эффективности и селективности разделения аналитов от концентрации мицеллообразующего агента – додецилсульфата натрия. Найдена оптимальная концентрация детергента - 25 мМ
3. В режиме МЭКХ (буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер (pH 7.0), 25 мМ ДДСН; 25 кВ; 200 нм) получены характеристические профили и проведен количественный анализ реальных объектов – различных сортов зеленого и черного чая.
4. Показано, что процессы комплексообразования полифенолов чая с казеином и ионами Fe3+ приводит к заметному снижению содержания полифенольных соединений.
5. Предложен экспресс-вариант определения кофеина в составе чая методом ВЭТСХ с пределом обнаружения 100 нг

Спасибо за внимание!

Схема биосинтеза полифенолов
Нарингенин (Ar = п-гидроксифенил)

Ауреузидин
(ауроны)
Флоретин
(дигидрохалконы)
Бутеин
(халконы)
Катехин
(флаван-3-олы)
Лейкофизетинидин
(флаван-3,4-диолы)
Нарингенин
(флаваноны)
Кверцетин
(флавон-3-олы)
Дельфинидин
(антоцианидины)
Таксифолин
(флаванонолы)
Типичные представители флавоноидов

Типичные представители нефлавоноидов
п-Кумаровая кислота (R = H) Галловая кислота Ресвератрол
Кофейная кислота (R = OH)

Полифенолы
Сложные эфиры
Простые эфиры
(-)-Эпигаллокатехин галлат
Нарингенин-7-глюкозид

Компоненты чая
Фенольные вещества
(до 30 %)
Эфирные масла
(0,02%)
Алкалоиды
(1-5 %)
Аминокислоты и белки
(16-25 %)
Пектиновые вещества
(2-6%)
Пигменты
(1-12 %)
Минеральные вещества
Витамины

Среднее содержание флаван-3-олов в побеге цейлонского чая

п-Кумаровая кислота (R = H)
Кофейная кислота (R = OH)
Ресвератрол
Желтый солнечный закат (Е110)
Красный очаровательный (Е129)
Важные соединения, содержащие фенольные гидроксилы
Полифенолы
нефлавоноидной группы
Синтетические пищевые
красители

[О] – ферменты, радикалы,
катионы металлов
Окисление полифенолов

Потенциалы окисления катехинов

Катехин
Дегидродикатехин
Окисление катехина ферментом пероксидазой
в растительных объектах

Определение общей антиоксидантной активности зеленого чая

pKa: 9.98
pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26
pKa: 8.72, 9.49, 11.23, 13.40
pKa: 4,27, 8,68, 11,45
pKa: 4,62 , 9,07

Предполагаемые структуры комплексов полифенол – Fe3+
?

Строение комплекса EGCG – Fe3+

Зависимость селективности разделения аналитов от концентрации ДДСН в буферном электролите

EGCG
Caf
306 nm
209 nm
273 nm
206 nm
УФ-спектры анионов эпигаллокатехин галлата и кофеина
Условия: растворы EGCG (400 мкг/л) и Caf (1 мг/л) в 10 mM боратном буфере pH 9,2
Спектрофотометр UV-1700 «Shimadzu»

4-диметиламиноцинамальдегида (ДМАЦА)
Спектрофотометрическое определение полифенолов

Преимущества ВЭТСХ
Экспрессность
Возможность параллельно проводить анализ нескольких образцов
Легкость смены элюента
Высокая эффективность

Сравнение ТСХ и ВЭТСХ
27

t0 – время выхода нейтральных сильно полярных соединений
tR – время выхода соединений с промежуточной гидрофобностью
tm – время выхода сильно гидрофобных соединений
Механизм разделения в МЭХК

H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Tagahi // Talanta. 2005. V. 46. P.717-726.

Влияние потребления кипяченой воды, свежезаваренного чая и свежезаваренного чая, содержащего 10% молока, на кровоток, обусловленный расширением сосудов (flow-mediated dilation (FMD))
16

Влияние катехинов на свойства растворов ДНК
Дозовая зависимость характеристической вязкости ДНК при УФ-облучении в отсутствии (1) и в присутствии (2) (+)-катехина в растворе
Спектры поглощения ДНК (1), (+)-катехина (2) и их смеси (3)
Точками показана сумма спектров (1) и (2)

Определение кофеина в реальных объектах

Казеин
Пролин

αs1-Казеин
κ-Казеин

Серинфосфат
Trp
Leu
Val
Ser
Pro

Казеин в форме мицелл

Казеин 150 мг/л
EGCG 20 мг/л
Казеин (150 мг/л) + EGCG (20 мг/л)

(+)-катехин
[2R,3S]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол
(-)-Эпикатехин
[2R,3R]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол
(-)-эпигаллокатехин
[2R,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол
(-)-Эпикатехин галлат
[2R,3R]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат
(-)-эпигаллокатехин галлат
[2R,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат
(-)-галлокатехин галлат
[2S,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат

Концентрация органических лигандов – 1∙10-4 М. Концентрация ионов железа –1∙10-4 М
1 – Резорцин, 2 - Пирокатехин
Резорцин
Пирокатехин

Оптимальные условия электрофоретического разделения смеси полифенолов и кофеина
Система капиллярного электрофореза Капель-105;
Капилляр: Lобщ = 60 см, Lэфф =50 см, dвнутр=75 мкм;
Буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7.0, 25 мМ додецилсульфата натрия;
Ввод: 30 мбар, 10 с; Напряжение: 25 кВ
Рабочая температура - 20°С
Длина волны: λ = 200 нм
13

17
Факторы, влияющие на
содержание полифенолов
в чайном напитке
Условия произрастания чая
Условия хранения (температура, влажность)
Время заваривания чая
Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями

19
Казеин
Влияние добавки казеина на электрофоретический профиль полифенолов
Проба: EGCG (20 мг/л)
Проба: смесь EGCG (20 мг/л) и казеина (6 мг/л)

Адсорбционная ТСХ
Caf
EC
EGCG
ECG
Caf
Реальный
объект
H = 0,02 мм
α(Caf/EC) = 0,68
Rs (Caf/EC) = 3,3
Rf=a/b – параметр удерживания аналита
N=16·(a/w)2 - число теоретических тарелок на разделяющем участке
Н=a/N – высота, эквивалентная теоретической тарелке
α=a1/a2 – коэффициент селективности двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый)
Rs = 2·(a2-a1)/(w1+w2) – коэффициент разрешения двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый)
a1, а2 - пути, пройденные аналитами
b – путь, пройденный элюентом от линии старта до линии фронта
w1, w2 – ширина пятна аналитов
29
Условия:
Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил»
п.ф. - CH3OH : CH3COOC2H5 = 1 : 3