Ферменты модификации ДНК

ФЕРМЕНТЫ МОДИФИКАЦИИ ДНК
Ферменты модификации ДНК в настоящее время научились синтезировать искусственно и применять для воздействия на ДНК таким образом, каким нам необходимо.
К этой группе белков относят:
лигазы (соединяют фрагменты нуклеиновой кислоты);
фосфатазы (удаляют концевые фосфатные группы нуклеиновой кислоты);
киназы (фосфорилируют концы нуклеиновой кислоты);
полимеразы и обратные транскриптазы (осуществляют синтез и удлинение цепи нуклеиновой кислоты);
трансферазы (катализируют присоединение групп атомов или нуклеотидов к нуклеиновой кислоте);
нуклеазы (специфически или неспецифически гидролизуют нуклеиновые кислоты);
другие белки (альбумин, ингибиторы рибонуклеаз, агараза, протеиназа К, пирофосфатаза)
фосфотрансферазы

ЛИГАЗЫ
ДНК-лигазы вирусов, бактерий, млекопитающих соединяют 5'-фосфатную и З'-гидроксильную группы нуклеотидов, находящихся на противоположных концах одноцепочечного разрыва в дуплексе ДНК. В результате образуется фосфодиэфирная связь, ликвидирующая этот разрыв.
Для образования фосфодиэфирной связи между концами нуклеотидных цепей ДНК-лигазы используют энергию гидролиза АТР либо NAD). Реакция протекает в три стадии.

ФОСФАТАЗЫ
Это фермент гидролаза, отщепляющая фосфат от нуклеотидов, белков и алкалоидов.
Наиболее часто щелочная фосфатаза применяется для удаления фосфатных групп с 5’-концов фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза эндонуклеазами рестрикции. Поскольку дефосфорилированные концы не сшиваются ДНК-лигазой, то такая обработка позволяет предотвратить самолигирование фрагментов ДНК, например, плазмидных векторов, предназначенных для последующего клонирования.
Димер щелочной фосфатазы бактерий. Синим выделен N-конец, красным — C-конец

КИНАЗЫ
Полинуклеотидкиназа катализирует передачу гамма-фосфата из АТФ в 5'-ОН-группу одно- и двухцепочечных ДНК и РНК, олигонуклеотидов или нуклеозидных 3'-монофосфатов (прямая реакция). Реакция обратима.
Иными словами, киназы осуществляют действие обратное фосфатазам, то есть присоединяют фосфатную группу к 5’ концу ДНК (РНК).
Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 используется для введения радиоактивной метки в ДНК (РНК) с целью получения радиоактивно меченных зондов или секвенирования НК.

Т4 ДНК-ПОЛИМЕРАЗА
ДНК-полимераза T4 - матрично-зависимая ДНК-полимераза, которая катализирует синтез 5'-3 'из праймированной одноцепочечной ДНК. Фермент обладает 3'-5 'экзонуклеазной активностью, но не обладает 5'-3' экзонуклеазной активностью.
Т4 ДНК-полимераза выделена из штамма E.coli, содержащего рекомбинантную плазмиду.
Оптимальная температура работы Т4 ДНК-полимеразы 37 °C.

ФРАГМЕНТ КЛЁНОВА
Это большой белковый фрагмент, образующийся при ферментативном расщеплении ДНК-полимеразы I из Escherichia coli протеазой субтилизином (subtilisin). Впервые фрагмент Кленова был описан в 1970 году, и имел 5’ → 3’-полимеразную активность в сочетании с 3’ → 5’-экзонуклеазной активностью (корректорной), но не имел 5' → 3'-экзонуклеазной активности.
На данный момент используется для маркировки ДНК ("fill-in" 3' укороченных концов с помощью "random hexamers"), для секвенирования ДНК методом Сэнгера и для синтеза второй цепи ДНК.