Физиология микроорганизмов

Химический состав бактерий.
Вода основной компонент бактериальной клетки, она находится в свободном и связанном состоянии.
Гидролитические процессы расщепления белков, углеводов и липидов происходят в результате присоединения к ним воды.
При недостатке воды нарушается и размножение бактерий.
Связанная вода определяет устойчивость к физическим факторам

В микробной клетке содержатся
углерод (45%), азот (8-15%), кислород (30%), водород (6-8%) и минеральные вещества от 3 до 10 % (фосфор, сера, магний, железо, кальций, калий, цинк, кобальт, медь и др.), Вода.

Минеральные вещества
стимулируют процессы роста и размножения бактерий,
определяют рН среды,
окислительно-восстановительный потенциал,
поддерживают осмотическое давление,
активность ферментативных процессов.

В составе бактерий имеются
белки,
углеводы,
липиды,
витамины.

Белки
В состав белков прокариот входят 20 аминокислот.
Белки входят в состав различных морфологических структур,
являются составными частями ферментов, токсинов, антигенов,
определяют отношение к красителям, лекарственным и дезинфицирующим веществам.
Они могут быть простыми и сложными
Простые белки при гидролизе распадаются на аминокислоты (лейцин, триптофан и др.).
Сложные белки (протеиды)- это соединения простых белков с небелковыми группами: нуклеиновыми кислотами, полисахаридами, липидами и др.

Углеводы (12-18%) массы бактерий
Представлены:
многоатомными спиртами (сорбит, дульцит, манит);
полисахаридами (гексозы, пентозы, гликоген, декстрин);
моносахаридами (глюкоза, глюкуроновая кислота и др. )
Углеводы выполняют главную энергетическую функцию и определяют антигенную специфичность микроорганизмов.

Липиды
Липиды (истинные жиры)встречаются у риккетсий, дрожжей, микобактерий, грибов и др.
Бактериальные липиды играют роль резервных веществ. Представлены свободными жирными кислотами, нейтральными жирами, восками, фосфолипидами.
Могут быть использованы как исходные компоненты для синтеза белков.
Входят в состав основной токсической фракции многих микроорганизмов.
Определяют проницаемость клеточных мембран, их стабильность
устойчивость к кислотам и щелочам, заряд клетки.

Метаболизм
- совокупность ферментативных реакций направленных на получение энергии и превращение простых соединений в макромолекулы.
- совокупность двух противоположных процессов:
катаболизма (энергетического метаболизма)
анаболизма (пластического, конструктивного метаболизма).
Питательные вещества,
поступающие в клетку, служат
источником энергии и
строительным материалом для
синтеза клеточных структур.

Особенность метаболизма бактерий
Большая площадь поверхности при малом объем клетки
Высокая интенсивность метаболизма
Огромная ферментативная насыщенность
Высокая проницаемость клеточной стенки и ЦПМ
Внеклеточное расщепление субстрата

Конструктивный метаболизм (анаболизм)
Поток реакций, в результате которых за счет поступающих извне веществ строится вещество клетки, сопровождается потреблением свободной энергии, запасенной в макроэргах.
В процессе анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений.

Питание (бактерий)
По способу питания бактерии относятся к
голофитным объектам (нет специализированных органов для принятия пищи).
питательные вещества поступают через всю поверхность микробной клетки в растворенном виде.
высокая пластичность к меняющимся условиям окружающей среды.
Особенности питания бактерий:

Механизмы питания у бактерий
Пассивная диффузия (по градиенту концентрации)
Облегченная диффузия (посредством системы
транслоказ и пермеаз по градиенту концентрации)
Активный транспорт (против градиента концентрации с помощью переносчиков и с затратами энергии)
Транслокация (модификация химического вещества) с затратами энергии

Пермеазы катализируют присоединение вещества-субстрата к активному центру на своей поверхности и проводят это вещество с наружной поверхности ЦПМ на внутреннюю.
Здесь пермеаза освобождается от вещества, а сама вновь вступает во взаимодействие с новой порцией субстрата.
Пермеазы составляют значительную часть белков ЦПМ.

Типы секреции:
I тип секреции
Требует наличия 3 белков:
Транспортной аденозинфосфатсинтетазы ЦПМ;
Белка ЦПМ, формирующего канал в периплазме;
Белка-секретина, образующего канал в пептидогликане.

Данная система осуществляет секрецию субстратов непосредственно из цитоплазмы. Продукты секреции изначально активны.
Данным путем секретируются в
основном пороформирующие токсины: гемолизин, металлопротеаза, а также внеклеточная аденилатциклаза у В. Pertussis.

II тип секреции
«общий секреторный путь» (GSP).
Секреторный аппарат формирует 12-14 белков, основная часть которых расположена в ЦПМ.
Секретируемые белки первоначально накапливаются в периплазме, где формируют молекулы четвертичной структуры, а затем происходит их удаление через канал, образованный в клеточной стенке белком секретином.

Система секреции состоит из двух частей и осуществляется в две стадии.
Sec-система направляет предшественников к транслокационному комплексу ЦПМ;
Через транслоказу пресекретируемый белок высвобождается в периплазматичекую щель, где принимает свою нативную конформацию и затем секретируется через клеточную стенку.
Белковые молекулы переходят через sec-аппарат в полностью развернутом виде.

III тип секреции
Обеспечивает не только перенос секреторных продуктов через мембранные структуры бактериальной клетки, но и доставку их внутрь эукариотических клеток.
Структурно представляет собой «молекулярный шприц», образованный двадцатью белками, преимущественно расположенными в ЦПМ.

Транспортируемые молекулы находятся в интактной форме и активируются только после попадания в цитоплазму эукариотической клетки-мишени.
Кроме интегральных мембранных белков в состав аппарата секреции входит и несколько цитоплазматических белков, участвующих в доставке секреторных продуктов к локусу секреции.

IV тип секреции
Обеспечивает выделение белков- аутотранспортёров.
У каждой молекулы существует терминальный N-участок с
сигнальной последовательностью, обеспечивающей
транспорт через ЦПМ, и терминальный С- участок,
формирующий пору в клеточной стенке, через которую
проходит остальная часть молекулы (сериновые протеазы
энтеробактерий -SPATE) .

V тип секреции
Отличается от II типа тем, что в периплазматичес-
ком пространстве из С-терминальной части секретируемого полипептида формируется бета-цилиндрическая структура, выполняющая роль поры, через которую проходит N-терминальный конец.
Внеклеточный протеолиз приводит секретируемый белок в активное функциональное состояние.

Типы питания
В зависимости от источников углерода
микроорганизмы делятся:
Автотрофы- синтезируют все компоненты из неорганического углерода (СО2)и воды
Гетеротрофы- источник углерода органические соединения

Строгие (облигатные) паразиты- живут только внутри клетки-хозяина;
Факультативные паразиты- существуют как внутри, так и вне клетки-хозяина;
Сапрофиты – используют органические остатки (растений и животных);

В зависимости от источников азота
микроорганизмы делятся:
Прототрофы- способны синтезировать азотсодержащие соединения из солей аммония, нитратов, нитритов и глюкозы.
Ауксотрофы- ассимилируют только готовые азотсодержащие органические соединения

Факторы роста микроорганизмов
макроэлементы (Ca, Mg, Fe, К, Mn)
микроэлементы (Co, Ni, Cu, Zn, Mo и др.)
Пурины и пиримидины
витамины

Синтез углеводов
Углеводы представлены в виде моно-, ди-, полисахаридов, а также комплексных соединений
Автотрофы синтезируют углеводы в реакциях восстановления пентозофосфатного цикла
Гетеротрофы - в гликолитическом пути и
путем глюконеогенеза (из неуглеводных предшественников)

Получение аминокислот прокариотами
Осуществляется из:
Пирувата, альфакетоглутората, фумарата (из цикла трикарбоновых кислот) в реакциях аминирования (ионами NH4) и переаминирования;
Из молекул белка (протеазы, пептидазы);
В готовом виде из клетки-хозяина

Синтез липидов
У бактерий преобладают длиноцепочечные
(С14-С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты с одной двойной связью.
Из промежуточных продуктов: ацетилкоэнзима А и диоксиацетилфосфата.

Энергетический метаболизм (катаболизм)
Поток химических реакций, сопровождающийся мобилизацией энергии и преобразованием ее в форму, которая затем может использоваться во всех энергозависимых процессах.
В процессе катаболических реакций происходит выделение энергии, которая накапливается в молекулах макроэргов.

В зависимости от источников энергии
Микроорганизмы делятся:
Фототрофы- способные использовать энергию света (фотосинтезирующие)
Хемотрофы- получают энергию за счет окислительных и восстановительных реакций

В зависимости от природы доноров электронов
Микроорганизмы делятся:
Хемолитотрофы (хемоавтотрофы)- Н2, Fe, NH3, CH3 и др.
Хемоорганотрофы (хемогетеротрофы)-органические соединения.
Большинство прокариот являются хемоорганогетеротрофами.

Механизмы получения энергии у бактерий:
Окислительный метаболизм (дыхание);
Бродильный (ферментативный) метаболизм
Смешанный метаболизм
фотосинтез

При окислительном метаболизме
Энергия образуется в реакциях окисления-восстановления, при которых донорами электронов могут быть органические и неорганические соединения, а акцептором- только молекулярный кислород.

Окисление происходит в результате переноса электронов через локализованную в мембране дыхательную электрон-транспортную цепь (мембранное фосфорилирование).

Организация дыхательной цепи

У микроорганизмов существует несколько типов богатых энергией соединений.
Самые многочисленные:
ацилфосфаты,
нуклеотидди- и трифосфаты,
аденозинфосфосульфат
ацилтиоэфиры

При анаэробном дыхании
происходит перенос высокоэнергетической фосфатной группы от молекулы-донора на АДФ с образованием АТФ.
Субстратное фосфорилирование
S- Ф + АДФ= S + АТФ

Ферментативный (бродильный) метаболизм
Процесс получения энергии при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения.
Брожение разновидность анаэробного дыхания.

В зависимости от типа конечных продуктов различают:
Спиртовое брожение
Маслянокислое
Молочнокислое
Муравьинокислое
Уксуснокислое
Пропионовокислое и др.

По способу дыхания
Анаэробы (облигатные –для них кислород токсичен; факультативные - растут и размножаются как при присутствии О2, так и без него);
Аэробы (облигатные)-содержание кислорода не ниже парциального давления воздуха до 40%
Микроаэрофилы- при пониженной концентрации О2 (ниже 2%).
Капнофилы- пониженное содержание О2 и повышенное СО2.

Ферменты бактерий
Все метаболические процессы протекающие в микроорганизмах являются ферментозависимыми.
Набор ферментов конкретных микроорганизмов определяется их генетической информацией.

По своей природе
ферменты-белки.
Ферменты распознают соответствующие субстраты,
вступают с ними во взаимодействие,
ускоряют протекание химических реакций.
Могут быть связаны с конкретными структурами микробной клетки.
Ферменты могут функционировать самостоятельно, или образовывать взаимосвязанные комплексы.

Классификация ферментов
(International Union of Biochemistry)
класс – подкласс- субподкласс.

По месту действия
различают:
Эндоферменты, катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки;
Экзоферменты- выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, усваиваемых клеткой.

Конститутивные ферменты- постоянно синтезируются в микробных клетках в определенных концентрациях (ферменты гликолиза).
Индуцибельные (адаптивные) ферменты
- их концентрация резко возрастает в зависимости от наличия соответствующего субстрата

Аллостерические ферменты – их активность меняется в зависимости от взаимодействия с метаболитами или субстратами. Активатором выступает субстрат. Накопление конечных продуктов метаболизма приводит к их ингибированию.

В зависимости от химической природы субстрата различают ферменты:
сахаролитические,
протеолитические,
липолитические.

Методы определения ферментативной активности
Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).
Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи).

Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2).
Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).
Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).

Питательные среды
Используют для выращивания микроорганизмов в искусственных условиях.
Они могут быть по консистенции: плотными, жидкими, полужидкими.
В зависимости от набора питательных веществ- простыми и сложными.

По целевому назначению питательные среды
Универсальные (МПА, МПБ);
Элективные (ЖСА, желчный бульон);
Дифференциально-диагностические (Эндо, Плоскирева);
Специальные: транспортные, обогащения,
с повышенной питательной ценностью и др.

Элективные (избирательные) питательные среды
Обеспечивают преимущественный рост определенной группы бактерий (желточно-солевой агар, желчный бульон)

Дифференциально-диагностические среды
Позволяют дифференцировать группы или виды бактерий по ферментативной активности
Среды Эндо, Левина, Плоскирева – по способности и неспособности ферментировать лактозу
Среды Гисса – используются на 3 этапе выделения чистой культуры для определения спектра сахаролитической активности.

Этапы выделения чистой культуры бактерий
1 этап:
микроскопия мазков или нативного материала;
посев на чашки с набором питательных сред (ЭС, ДДС, СО).
2 этап:
Изучение морфологии клеток и их тинкториальных свойств;
Изучение культуральных свойств изолированных колоний (Пересев на скошенный агар)
3 этап:
Проверка однородности выделенной культуры;
Идентификация культуры по биохимическим и антигенным свойствам,
определение вирулентных свойств (лабораторных животных)
определение чувствительности в антибиотикам и бактериофагам

Рост бактерий
Координированное увеличение количества всех компонентов микробной клетки (массы клетки).

Размножение бактерий
Увеличение количества клеток в популяции
Поперечное деление:
Синтеза поперечной перегородки ( у грам+ бактерий)
Образования перетяжки ( у грам «-» бактерий)

Эффективность размножения микроорганизмов оценивается:
- Концентрацией клеток культуры в мл.
Временем генерации- промежутком времени за который число клеток удваивается
Константой скорости деления- число удвоений в час
- Константой скорости роста

Стадии развития микроорганизмов в жидкой питательной среде:
Стационарная фага (отсутствия роста) длится 1 -2 часа.
Лаг-фаза- приспособления. Размножение бактерий идет медленно в следствие адаптации к условиям среды
Лог-фаза- экспоненциального роста. Увеличение количества бактерий в геометрической прогрессии.
Фаза отрицательного ускорения - уменьшения скорости деления бактерий
Стационарная фаза. Количество погибающих и образующихся клеток равно.
Фага гибели- включает в себя гибель микроорганизмов вначале в логарифмической прогрессии, а затем скорость отмирании снижается.
Бактерии могут сохраняться в виде покоящихся форм и спор.

На плотной среде
бактерии образуют
колонии, которые
различаются по
своим свойствам

Методы оценки состояния микробной культуры
Прямые (непосредственный подсчет клеток под микроскопом в счетных камерах или фиксированных мазках)

Косвенные (высев на плотные питательные среды, осаждение на мембранных фильтрах, мутность суспензии, определение биомассы, общего азота, белка и др.)

Метод проточной цитометрии позволил изучать физиологическое состояние отдельных клеток.

Каротиноиды- жирорастворимые пигменты красного, желтого и оранжевого цвета (микобактерии)
Пирроловые- спирторастворимые: продигиозин (Serratia marcescens);
Фенозиновые- водорастворимые пигменты синие или зеленые:
пиоцианин (синегнойная палочка)
Меланины- нерастворимые пигменты черного и коричневого цвета (порфиромонасы)