Исследование влияния антимикробных пептидов пиявки Hirudo medicinalis на нейтрофилы человека

Актуальность и обоснование работы
В связи с развитием резистентности микроорганизмов к традиционным антибиотикам необходимы новые антимикробные препараты. Перспективными в этом отношении считаются катионные антимикробные пептиды (АМП), к которым, как правило, не развивается резистентность.
К АМП пиявки как потенциальному лекарству имеется особый интерес. Поскольку пиявка как кровососущий организм, использующий теплокровных животных, включая человека, эволюционировала одновременно с ними и синтезировала соответствующие АМП для своей защиты, то можно полагать, что её АМП могут быть полезны для медицинских целей борьбы с бактериальными инфекциями человека.
Поскольку в очаге инфекции АМП будут соседствовать с нейтрофилами, то необходимо в тестирование АМП как потенциального лекарства включить исследование их взаимодействия с нейтрофилами.
1

Катионные АМП, использованные в работе
Пептиды были синтезированы на основе биоинформатического анализа генома пиявки Hirudo medicinalis в лаб. генной инженерии (зав. лаб. докт. биол. наук, проф. В.Н. Лазарев) ФНКЦ ФХМ ФМБА России.
2

Цели и задачи исследования
Цель
Исследование взаимодействия между пептидами и нейтрофилами на трех уровнях:
Целая клетка
Миелопероксидаза (МПО), секретируемая активированными нейтрофилами
HOCl – хлорноватистая кислота, образующаяся в организме в результате хлорирующей активности МПО при катализе реакции Cl¯ + H2O2 → HOCl + H2O
Конкретные задачи
Влияние пептидов на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (в цельной крови) и на жизнеспособность нейтрофилов (изолированные клетки)
Влияние пептидов на хлорирующую активность МПО
Влияние HOCl на структуру пептидов
3

Нейтрофил (слева) и нейтрофильная внеклеточная ловушка (справа) на фотографиях мазков крови
4

Пептид 536_1 в цельной крови усиливает образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ)
5

Пептид 536_1 в цельной крови вызывает уменьшение числа лейкоцитов
6

Влияние пептидов на жизнеспособность нейтрофилов
(в суспензии изолированных нейтрофилов)
7

Оценка хлорирующей активности МПО
Метод taurine chloramine assay [Kettle, 1994]. Метод основан на реакции HOCl с таурином с образованием хлорамина таурина, который затем измеряется по реакции с тионитробензойной кислотой, которая в результате теряет поглощение (412 нм).
Как и другие методы измерения HOCl, продуцированной МПО, этот метод имеет ограничения, связанные с присутствием в среде веществ, способных перехватывать HOCl у таурина (константа скорости реакции таурина с HOCl k = 5,0 × 105 М−1с−1 при нейтральном рН).
В исследуемых пептидах есть аминокислотные остатки, быстро реагирующие с HOCl.
Константы скорости реакции (нейтральный pH):
Cys 3,6 х 108 M-1 s-1
Met 3,4 х 107 M-1 s-1
Trp 7,8 х 104 M-1 s-1
Lys 7,9 х 103 M-1 s-1
Наши контрольные эксперименты по измерению HOCl, добавленной в виде реагента (вместо МПО/H2O2) показали, что пептиды до концентрации примерно 5 мкМ не “мешают” измерять концентрацию HOCl в присутствии 40 мМ таурина.
8

Влияние пептидов на хлорирующую активность МПО
Измерялось количество HOCl, образовавшееся в первые 2,25 мин после добавления
25 мкM Н2О2 к 3,5 нM МПО и 140 мM Cl¯ . В отсутствии пептидов МПО за это время утилизировала примерно половину добавленного Н2О2.
9

Регистрация повышенного количества HOCl в среде, содержащей систему МПО/Cl-/H2O2 в присутствии пептида 536_1, связана именно с HOCl, образующейся в результате функционирования МПО
10

Сравнение влияния пептида 536_1 и глутатиона восстановленного на хлорирующую активность МПО
11

Влияние пептидов на пероксидазную активность МПО
Влияния не было обнаружено. Пероксидазная активность МПО измерялась с использованием о-дианизидина в качестве субстрата по кинетике поглощения окисленного о-дианизидина при 650 нм.
Возможный механизм “активирующего” действия пептида 536_1
на хлорирующую активность МПО
HOCl может прореагировать с молекулой МПО, вызывая инактивацию. Вещества, способные к реакции с HOCl, могут, перехватывая HOCl, “спасать” МПО от этой самоинактивации. Такая роль есть у таурина в методах измерения хлорирующей активности. Возможно, тиоловая группа цистеина, скорость реакции которой с HOCl на три порядка выше, чем у таурина, настолько эффективно перехватывает HOCl, что может дополнительно существенно предохранить МПО от модификации и самоинактивации, что проявляется в ускорении продукции HOCl в растворе МПО.
12

MALDI-масс-спектрометрия
Если предполагать использование АМП в качестве медицинского препарата, то следует учитывать, что вследствие наличия в них определенных аминокислот они в очаге инфекции окажутся мишенями для HOCl, генерируемой активированными нейтрофилами. В связи с этим была поставлена задача определить изменения в структуре пептидов под воздействием HOCl и получить сравнительную оценку их устойчивости к HOCl. Для решения этой задачи был использован метод MALDI-масс-спектрометрии.
Образцы готовили, инкубируя пептиды (5 мкМ) с возрастающими концентрациями HOCl. Мольное отношение HOCl:пептид было от 1:1 до 50:1. При этом наибольшее мольное отношение HOCl:реакц.группы составило 10:1.

Триптофан
Лизин
Цистеин
Метионин
13

Продукты реакций пептидов с HOCl,
идентифицированные в спектрах MALDI
По мере увеличения концентрации HOCl пик нативного пептида уменьшался до полного исчезновения. Однако в случае пептидов 3967_1 и 12530 еще сохранялась целостность полипептидной цепи. Пептид 536_1 оказался наименее стойким к воздействию HOCl: при HOCl:пептид = 5:1 (моль/моль) происходило разрушение полипептидной цепи на фрагменты.
14

1. В цельной крови пептид 536_1 усиливал образование нейтрофильных внеклеточных ловушек и вызывал уменьшение числа лейкоцитов. Пептиды 3967_1 и 12530 не проявили достоверного эффекта.
2. В суспензии изолированных нейтрофилов пептиды 12530 и 536_1 при концентрациях равной их МИК вызывали уменьшение числа живых клеток (на 70% и 30%, соответственно, через 1 ч инкубации при 37оС). Количество живых клеток после инкубации с пептидом 3967_1 не отличалось достоверно от их количества в контроле.
В присутствии пептида 536_1 возрастала скорость продукции HOCl миелопероксидазой.
4. В пептидах, обработанных HOCl, происходило образование продуктов оксигенирования и хлорирования. Пептид 536_1 оказался наименее устойчивым к HOCl, распадаясь на фрагменты, тогда как пептиды 396_1 и 12530 при аналогичном мольном отношении HOCl/пептид сохраняли полипептидную цепь целой.
Результаты позволяют предложить пептид 3967_1 как более подходящий по сравнению с пептидами 12530 и 536_1 для дальнейшего усовершенствования структуры, повышающего её устойчивость в условиях активации нейтрофилов и уменьшающего негативное влияние на эти клетки.
Выводы
15

Результаты работы были представлены на 3-ем Сеченовском Международном Биомедицинском Саммите: E.A. Menyaylo et al. Novel cationic antimicrobial peptides of Hirudo medicinalis and their initial evaluation as potential medicinal agents. 3rd Sechenov International Biomedical Summit (SIBS 2019). May 20-21, 2019. Sechenov University, Moscow, Russia. P-30.
Тезисы будут опубликованы в открытом электронном журнале Biomedicine HUB.
16

Благодарности
Сотрудникам лаборатории физико–химических методов исследования и анализа,
Д. С. Матюшкиной (лаб. простых систем) за помощь в проведении MALDI,
С. А. Гусеву и Л. Ю. Басыревой (лаб. морфологии) за обучение методике измерения нейтрофильных внеклеточных ловушек в крови
17

18

19