Методы окраски крови, окраска по Романовскому

Этапы
1. Приготовление
мазка
2. Высушивание (и маркировка)
3. Фиксация
4. Окрашивание

Начало
Чеслав Иванович Хенцинский (1851-1916) – российский патологоана-том, эпидемиолог
Метиленовый синий
+ эозин
Двухцветная окраска
Дмитрий Леонидович Романовский (1861-1921) – российский военный врач, гематолог, инфекционист
Метиленовый синий + эозин + Азур В
Полихромная окраска

Дмитрий Леонидович Романовский
Русский ученый-маляриолог, терапевт, гематолог
В 1891 году предложил состав нового красителя - Азур

Окраска по
Романовскому
Окр. по Дженнеру
Окр. по Май-Грюнвальду
Окр. по Лейшману
Окр. по Райту
Окр. по Гимзе
Окр. по Паппенгейму

Модификации методики
Фиксация
в метаноле
1901 – Лейшман
1902 - Райт
1904 – Гимза
Стандартизация растворов красителя, добавление глицерина
Вильям Буг
Лейшман (1865-1926) – шотланд. патолог
Дж.Райт (1871-1928) – америк. патолог
Густав Гимза
(1867-1948) – немецкий химик
и бактериолог
?

Модификации красителя
Изначально краска Романовского готовилась на ВОДЕ (краска Романовского-Райта)
В настоящее время
готовый краситель
азур-эозин по Романовскому
готовится на метиловом спирте
с добавлением глицерина
Гимза (1904) – добавление ГЛИЦЕРИНА
Лейшман и Май-Грюнвальд (1901) – добавление МЕТАНОЛА в краску

Метиленовый синий (метиленовый голубой)
↓
Азур I (синонимы: Азур А, Азур метиленовый, диметилтионина хлорид)
↓
Азур II (синонимы: Азур В, триметилтионин)
Азур II = азур I (1 ч.) + метиленовый синий (1 ч.)
Азур II-эозин — смесь азур-эозина и эозин-метиленового синего.
«Красители в биологии и медицине» (Е. Селиванов)

Азур-эозиновый краситель -
Краска Романовского
Краска Романовского сочетает в своем составе эозинат (химически восстановленный эозин) с азуром Б (II) (продукт окисления метиленового синего)
Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Краска
Романовского
Ацидофильные («любящие кислоту»)
компоненты клетки имеют ЩЕЛОЧНУЮ реакцию,
поэтому воспринимают кислый краситель эозин.
Базофильные («любящие основания»)
участки обладают КИСЛОЙ рН, поэтому взаимодействуют
с щелочным красителем метиленовый синий (азур))

Наиболее распространенные красители для гематологических исследований:
Краска Романовского-Гимза
Краска-фиксатор Май-Грюнвальд (или Лейшмана)
Качество окраски клеточных элементов зависит от:
его концентрации;
продолжительности окраски;
возраста окрашиваемого препарата (препараты от 6 ч до неск. дней давности теряют мелкие структурные особенности);
pH среды (6.8 – 7.2)

Современные модификации
окраски мазков крови
Окраска по
Романовскому (Романовскому-Гимзе)
Окраска по
Паппенгейму
(Паппенгейму-Крюкову)
Окраска по
Нохту
Д.Л. Рома-новский
Бернард Нохт
(1857-1945) –
нем. врач, спец. по тропич. медицине, создатель Института тропич. медицины
Александр
Николаевич Крюков (1878-1952) – совет. гематолог
А.Паппенгейм (1870-1916) – немецкий терапевт
Г. Гимза

ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ(-ГИМЗЕ)
Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (3-5 мин) или в этиловом (30-40 мин);
Погружают в рабочий раствор готовой краски Романовского-Гимза* на 15-30 мин;
Промывают дистиллированной водой, высушивают, исследуют при иммерсии.
* Для приготовления РАБОЧЕГО раствора краску Романовского разводят в фосфатном буфере (обычно на 1 мл буфера 1-2-3 капли краски)

ОКРАСКА МАЗКОВ ПО ПАППЕНГЕЙМУ(-КРЮКОВУ)
На высушенный мазок наливают краску-фиксатор Май-Грюнвальда* (или Лейшмана) на 2-3 мин.;
Не сливая краски добавляют тоже количество дистил. воды;
Через 1 мин краску сливают и сразу добавляют рабочий раствор готовой краски Романовского-Гимза на 8-15 мин. (или рабочий раствор краски по Нохту);
Промывают дист. водой и высушивают.
* Состав: краска-фиксатор: 0,25-0,30 %-ный метанольный раствор смеси красителей метиленового синего, азура I и эозина

В состав раствора по Май-Грюнвальду входит метанольный раствор 0,25% концентрации. Раствор представляет собой смесь красителей метиленового синего, эозина и азура I
В состав раствора типа Лейшмана входит метанольный раствор 0,15% концентрации. Раствор представляет собой смесь красителей метиленового синего, эозина и азура I

НАПРИМЕР:
Краситель Азур-Эозин по Романовскому (МиниМед-Р) представляет собой 0,76 % раствор сухого красителя азур-эозин по Романовскому в смеси метанол-глицерин (1:1).
Краситель-фиксатор эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (МиниМед-М-Г) представляет собой 0,25% раствор сухого красителя эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду в метаноле.
Краситель-фиксатор Эозин метиленовый синий типа Лейшмана (МиниМед-Л) представляет собой 0,20% раствор сухого красителя эозин метиленовый синий типа Лейшмана в метаноле.

ОКРАСКА ПО НОХТУ
Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в этиловом (30-40 мин);
Погружают в рабочий раствор краски по Нохту* на 20-45-30 мин (готовится непосредственно в лаборатории);
Промывают дистиллированной водой, высушивают, исследуют при иммерсии.
* Для окраски по Нохту чаще всего используют 2 водных раствора, которые смешиваются непосредственно перед окраской:
1-промилльный раствор азура II;
1-промилльный раствор эозина.

Готовый краситель Романовского (концентрат)
РАБОЧИЙ раствор краски Романовского
Фосфатный буфер (концентрат)
РАБОЧИЙ раствор фосфатного буфера

Сравнение модификаций