Микрогаметофит. Созревание, покой и прорастание. Лекция 3

Метаболизм мужского гаметофита
На протяжении развития пыльцевого зерна идет интенсивный рост объема и сухой массы вегетативной клетки, увеличивается число органелл, исчезают вакуоли и накапливаются РНК и белки.
Мужской гаметофит готовится к выходу из-под защиты спорофита, и в то же время создает ресурсы для прорастания и быстрого роста пыльцевой трубки.
Перед выходом из пыльника пыльца приближается к физиологическому покою и дегидратируется.

Биосинтетическая активность
Синтетическая активность вегетативной клетки существенно изменяется на протяжении развития мужского гаметофита.
Скорость синтеза РНК в премитозной микроспоре табака составляет около 56 фг/ч. В растущем пыльцевом зерне она поднимается до 460 фг/ч – это максимум. Позже скорость снижается.
Аналогичным образом проходят через максимум другие показатели биосинтетической активности: доля рибосом, собранных в полисомы, и размеры ядрышка.
К концу созревания пыльцевого зерна уменьшается интенсивность его дыхания, а внутриклеточный pH сдвигается в кислую сторону.

Специфичные и обычные
1. Гены «домашнего хозяйства»(housekeeping genes), которые экспрессируются также в соматических клетках растений.
2. Гены, которые встречаются в других клетках, но в ♂гаметофите экспрессируются более активно (10-26%).
3. Гены специфичные для микроспор/пыльцы (4 -11% ). Для сравнения, в соматических тканях совокупная доля групп 2 и 3 составляет около 3%.
Относительно высокий уровень экспрессии специфичных и предпочтительных генов отражает функциональную уникальность мужского гаметофита, его роль в защите и доставке гамет.

Концепция 3-х стадий (протеом)
1 стадия – от микроспороцита до молодой микроспоры
2 стадия – поляризованная микроспора
3 стадия – пыльцевое зерно и трубка

Относительное содержание элементов на разных стадиях гаметофитогенеза
Андреюк ДС, Богданов АГ, Матвеева НП, Тукеева МИ, Ермаков ИП. Динамика элементного состава локулы пыльника в процессе гаметофитогенеза у табака. Онтогенез. 1998. Т.29, № 5, с.335-341.

рН и поглощение кислорода в процессе гаметофитогенеза
рН
Стадия 1
Стадия 2
Стадия 3
Стадия 3
Стадия 2
Стадия 1
V
Матвеева Н.П., Войцех О.О., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. Роль Н+-АТФазы и альтернативной оксидазы в регуляции величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака // Онтогенез 2002.т.33 " 6. С. 436-443.

Поляризация и деления микроспоры, формирование оболочки
Метаболизм, транскриптом и протеом мужского гаметофита
Дегидратация пыльцевых зерен
Адгезия и регидратация пыльцевых зерен на рыльце пестика, выбор функциональной апертуры
Активация пыльцевых зерен
Цитомеханика стенки пыльцевого зерна и пыльцевой трубки
Закономерности полярного роста пыльцевой трубки
Особенности прогамной фазы у голосеменных
растений

Изменение оводнённости
Степень гидратации мужского гаметофита изменяется в ходе его развития.
1) Формирование пыльцевого зерна, когда оно погружено в локулярную жидкость, через которую проходят вещества, поставляемые спорофитом.
2) Созревание и дегидратация пыльцевого зерна в пыльнике до его раскрытия. Локулярная жидкость в это время реабсорбируется и/или испаряется.
3) Фаза презентации, когда пыльца высыпается из раскрывшегося пыльника.
4) Распространение пыльцы посредством различных агентов – ветра, животных (насекомых, зверьков и птиц). Эта фаза может длиться, в зависимости от вида растения, от нескольких секунд до нескольких дней.
5) Взаимодействие пыльцы и рыльца. Попав на рыльце, при благоприятных условиях пыльцевые зерна регидратируются и начинают прорастать.

Дегидратация
Пыльцевые зёрна подразделяют на частично дегидратированные (<20-30%) и частично гидратированную (>20-30%). Первая сохраняется дольше, прорастает медленнее.

Дессиком
Это набор генов, белков и метаболитов, обеспечивающих устойчивость клеток к дегидратации
Включает регуляторные механизмы и сигнальные пути, контролирующие индукцию защитных механизмов

Гены, входящие в дессиком
Стабилизация мембран и белков с помощью невосстанавливающих сахаров, белков теплового шока и LEA-белков, которые могут действовать как шапероны или «молекулярные щиты», препятствуя агрегации клеточных белков.
Защита от окислительного стресса с помощью антиоксидантов.
Защита клеточных структур: стенки, эндомембран, цитоскелета и др.

Поляризация и деления микроспоры, формирование оболочки
Метаболизм, транскриптом и протеом мужского гаметофита
Дегидратация пыльцевых зерен
Адгезия и регидратация пыльцевых зерен на рыльце пестика, выбор функциональной апертуры
Активация пыльцевых зерен
Цитомеханика стенки пыльцевого зерна и пыльцевой трубки
Закономерности полярного роста пыльцевой трубки
Особенности прогамной фазы у голосеменных
растений

Активация пыльцевого зерна
Активация дыхания (скорость процесса зависит от состояния митохондрий)
Сдвиг рН в щелочную сторону
Гиперполяризация плазмалеммы вегетативной клетки

Динамика рН и скорости поглощения кислорода в процессе активации зрелого ПЗ in vitro
10 мин
20 мин
27 мин
рН
10 мин
20 мин
27 мин
5 мин
V
Матвеева Н.П., Войцех О.О., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. Роль Н+-АТФазы и альтернативной оксидазы в регуляции величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака // Онтогенез 2002.т.33 " 6. С. 436-443.

Два оптических метода оценки Em
Ратиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:
Съемка в двух каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным (Fg) светом – нет зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя;
Не выцветает и быстро реагирует на изменения – позволяет регистрировать динамику.
Медленный краситель DiBAC4(3):
позволяет определить абсолютные значения Em (расчет ведется относительно полностью деполяризованных клеток)
Прост в использовании: позволяет работать с большими популяциями клеток, набирая статистические данные.

H+-АТФаза плазмалеммы
Этот фермент – один из важнейших в растительной клетке. Выкачивая протоны, он влияет на величину внутриклеточного рН, генерирует протонный электрохимический градиент и формирует мембранный потенциал, обеспечивая тем самым трансмембранное перемещение ионов и метаболитов.
Heidi Pertl et al. 2010
Obremeyer et al., 1992

Всему голова – Са2+
Концентрация кальция возрастает в месте выхода пыльцевой трубки
Ингибиторы подавляют прорастание.
Iwano et al., 2004

Вблизи апертуры, через которую выйдет пыльцевая трубка, собираются везикулы Гольджи, митохондрии и короткие цистерны ЭПР, подготавливая строительство новой стенки.
Рибосомы собираются в полисомы, стопки ЭПР распадаются на отдельные цистерны, увеличивается активность аппарата Гольджи.
К моменту прорастания пыльцевое зерно имеет отчетливую полярную ось.
5 мин
15 мин
Реорганизация цитоплазмы

Поляризация и деления микроспоры, формирование оболочки
Метаболизм, транскриптом и протеом мужского гаметофита
Дегидратация пыльцевых зерен
Адгезия и регидратация пыльцевых зерен на рыльце пестика, выбор функциональной апертуры
Активация пыльцевых зерен
Цитомеханика стенки пыльцевого зерна и пыльцевой трубки
Закономерности полярного роста пыльцевой трубки
Особенности прогамной фазы у голосеменных растений

Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету: доставка стройматериалов и энергообеспечение
Клеточная стенка – механическая составляющая
Ионные градиенты и мембранный потенциал
ГТФазы и другие компоненты сигнальных каскадов
АФК
Основные игроки

Апикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за счет полярной организации цитоплазмы и циклоза. Пыльцевая трубка разделена на функциональные компартменты:
Полярность структуры

Функции циклоза
1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).
2. Транспорт в апекс сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с пестиком.
3. Строительные материалы, включая фосфолипиды, полисахариды, стеночные ферменты.
4. В апексе везикулы доставляются в определенные зоны поверхности, где происходит их экзоцитоз.
5. Эндоцитоз обеспечивает приток в трубку из пестика питательных веществ и сигнальных молекул, поддерживает «уникальность апекса» и правильное соотношение между материалами для строительства стенки и плазмалеммы.

Актиновые цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного роста
Продольные актиновые тяжи обеспечивают ток цитоплазмы и органелл (циклоз)
Микрофиламенты взаимодействуют с микротрубочками в процессе доставки мужского гаметного модуля
Кольцевая структура в субапикальной зоне обеспечивает обособление растущего компартмента
Микрофиламенты

Микротрубочки
Играют ключевую роль в доставке мужского гаметного модуля
У цветковых не участвуют в циклозе
У голосеменных участвуют в циклозе
Часто располагается вместе с микрофиламентами, а также образует комплексы с ПМ и ЭПР

Везикулы аппарата Гольджи, содержащие материал для строительства апикальной мембраны и стенки, путешествуют в апекс по актиновым филаментам.
В субапикальной зоне происходит рециклирование мембран (необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса»).
В кончике трубки везикулы образуют конус (у голосеменных – полумесяц)
Везикулярный транспорт
Bove et al., 2008
Kroh, Knuiman, 1985

Клеточная стенка: градиент жёсткости
Движущей силой для роста является тургорное давление. Однако, оно не является направленной силой, а одинаково в каждой точке. За счет чего же рост становится направленным?
Механический градиент жесткости обеспечивают компоненты клеточной стенки, в первую очередь, пектины (разной степени сшитости), целлюлоза и каллоза.
Chebli, Geitmann, 2007

Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитоза
По мере удаления от кончика они деэтерифицируются при участии фермента пектинметилэстеразы (ПМЕ)
Кальций участвует в образовании сшивок между молекулами пектинов, увеличивая прочность полимерной сети
Это обеспечивает градиент жесткости от кончика к ПЗ
Пектины
Кислые пектины
Метилированные пектины
Li et al., 1994
Parre, Geitmann, 2005

Каллоза
Breygina et al., 2012
Xie et al., 2012
Отсутствует в кончике
Появляется на расстоянии 10-30 мкм
Образует каллозные пробки в длинных трубках
Откладывается в кончике в ответ на
стрессовое воздействие

Жесткий компонент, но его не очень много
Отложение также неравномерное: в кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению к ПЗ.
Целлюлоза
Parre, Geitmann, 2005

Фосфолипидный сигналлинг
Гидратация и дегидратация
Цитоскелет
Экзо- и эндоцитоз
ГТФазы
Трансмембранный ионный транспорт
Универсальные регуляторные механизмы

Регуляторные механизмы: фосфолипиды
Фосфатидная кислота сосредоточена в субапикальной плазмалемме, т.е. в зоне расположения актинового кольца.
Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) локализован в плазмалемме апекса трубки.
Фосфатидная к-та - субапекс
FRAP
New Phytol. 2014 Jul;203(2):483-94. doi: 10.1111/nph.12814

Его узкая локализация обеспечивается белком phosphotidylinositol transfer protein (PITP) и фосфолипазой C (PLC), которая режет PIP2 с образованием инозитол-3-фосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG)
Этот процесс необходим для поддержания ионных градиентов и полярной структуры актиновых тяжей (через регуляцию актин-связывающих белков).
Регуляторные механизмы: фосфолипиды
Helling et al., 2006

ROP ГТФазы и рецепторные киназы
В клетках растений основную роль играют мономерные (малые) G белки (20-30 кДа).
Эти ГТФазы цилически переходят из неактивной цитозольной формы (G-ГДФ) в активную форму (G-ГТФ), связанную с мембраной
Guanine nucleotide dissociation inhibitor
GTPase-activating protein
Guanine nucleotide exchange factor

Малые ГТФазы, обозначаемые как Rac/Rop или ROP (Rho of plants) выполняют функции клеточных хабов – центральных переключателей и интеграторов сигналов.
В качестве мишеней для активированных ГТФаз могут, в частности, служить белки, связанные с функционированием цитоскелета и везикулярным транспортом.

RAC/ROPs и начальные стадии прорастания
Активация пыльцы как in vitro, так и in vivo сопровождается активацией ROP ГТФаз (NtRAC).
В чистой воде этого не происходит!
В условиях in vitro высокий уровень активированных ГТФаз поддерживается на протяжении 30 мин, после чего снижается примерно к 60 мин.
Одной из мишеней этих белков в данном случае является актиндеполимеризующий фактор ADF.
Molecular Plant 2013 6, 1358-1361DOI: (10.1093/mp/sst074)

Регуляция по принципу обратной связи
Рецепторная киназа RLK активирует фактор обмена нуклеотидов GEF, ROP переводится в активное состояние.
Отрицательную обратную связь осуществляют две группы белков:
GAP (GTPase-Activating Protein) – белки, стимулирующие ГТФазную активность, – переводят ROP в неактивное состояние.
GDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors) удерживают неактивный белок ROP1 в цитозоле.

ROP1 в трубке
В растущей пыльцевой трубке специфичная для пыльцы ГТФаза ROP1 локализована преимущественно в апикальной плазмалемме.
Экспериментальный сдвиг баланса активации ROP1 в ту или другую сторону приводит к полной остановке роста (снижение) или вызывает расширение кончика (повышение)

Эффекторные белки
Путь, идущий через RIC4, приводит к сборке актиновых микрофибрилл и контролирует накопление везикул, несущих материалы для апикального роста.
Путь RIC3 активирует накопление кальция в кончике пыльцевой трубки, стимулирует деполимеризацию актина и слияние везикул с плазмалеммой.
Эти два пути согласованно работают, регулируя динамику F-актина и экзоцитоз.

Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель для изучения ИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя
Работу ионных каналов и помп
Их дифференциальную регуляцию
Градиенты концентрации ионов в цитоплазме
Электрическое поле и мембранный потенциал
Ионная регуляция
Michard E. et al. 2009. Int. J. Dev. Biol. 53: 1609-1622; Gutermuth T. et al., 2013. Plant Cell. 25: 4525.

Основные закономерности прорастания и роста пыльцевого зерна: ионный статус
Feijó et al. 1992; Pertl et al. 2001; Hepler et al. 2006; Gutermuth et al. 2013; Zhao et al. 2013
SLAH3, SLAC1, ALMT12, CLCC, CLCD
CNGC7, CNGC8, CNGC9, CNGC10, CNGC16, CNGC18, GLR1.2, GLR1.3, GLR2.1, GLR3.3, GLR3.7, GLR1
SPIK, TPC1
ACA9
Ряд известных белков, обеспчивающих транспорт ионов:

Регуляторные механизмы: кальций
Hepler, 2012
Кальций входит в кончике трубки через каналы , а в субапикальной области входит в органеллы и выкачивается через ПМ с помощью помпы.
Таким образом, поддерживается крутой градиент его концентрации в апикальной зоне
Кальций – центральный регулятор роста, с нарушением градиента рост прекращается

Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с ПМ и, таким образом, задает направление роста
Кальций регулирует динамику актиновых филаментов через Са-чувствительные актин-связывающие белки (ABPs),
Кальций модулирует активность Са-зависимых протеин-киназ (CDPKs)
Регуляторные механизмы: кальций
Michard et al., 2008

В кончике рН кислый, протоны входят в цитоплазму, предположительно, через неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только в растущих трубках.
В субапикальной зоне обнаружен «щелочной поясок», именно в этой зоне работают Н+-АТФазы, выкачивающие протоны. Присутствует даже в нерастущих трубках.
Протонный градиент
Chebli, Geitmann, 2007
Michard et al., 2008
Podolyan et al., 2019

контроль
ортованадат
фузикокцин
Брейгина и др., 2010
Градиент мембранного потенциала
контроль
ортованадат
NPPB
Брейгина и др., 2010

АФК ионный транспорт ?
АФК в прогамной фазе оплодотворения, по-видимому, могут передавать сигнал и регулировать рост. Но как?
В соматических клетках ключевыми мишенями для АФК являются ионные каналы: Са2+ и К+.

Активные формы кислорода (АФК) - высокореакционные, метастабильными агенты (молекулы, ионы, радикалы), обладающие избыточной энергией по отношению к молекулярному триплетному кислороду (3O2).
Активные формы кислорода (АФК)
K. Apel, H. Hirt, Annu. Rev. Plant Biol. 2004 55:373-399

АФК и пероксидазы на рыльце
Пероксидазы и АФК накапливаются при подготовке к опылению.

АФК как сигнал: H2O2 активирует Ca2+ ток и вход Ca2+ в цитоплазму
Breygina et al., 2016. Plant Biol.18: 761-67.
H2O2-индуцированный вход Ca2+ в цитоплазму (краситель Fluo-3) в протопластах табака и трубках лилии
10 µМ H2O2
10 µМ H2O2+ нифедипин
H2O2-активируемый входящий Ca2+ ток в протопластах лилии
Podolyan et al., 2019
Breygina et al., 2016
Максимов и др., 2015

АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+
Сравнение средней плотности тока при (в % от контроля).
H2O2 – активирует K+ ток; TEA – ингибитор K+ каналов, блокирует ток. Все отличия достоверны (p < 0.05 критерий Уилкоксона).
Средние вольт-амперные характеристики выходного K+ тока.
Breygina et al., 2016

АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках «щелочной поясок»
В растущих трубках лилии вслед за массированным входом кальция происходит сглаживание градиента рН, что указывает на ингибирование Н+-АТФазы
контроль
H2O2
Podolyan et al., 2019

Два оптических метода оценки Em
Ратиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:
Съемка в двух каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным (Fg) светом – нет зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя;
Не выцветает и быстро реагирует на изменения – позволяет регистрировать динамику.
Медленный краситель DiBAC4(3):
позволяет определить абсолютные значения Em (расчет ведется относительно полностью деполяризованных клеток)
Прост в использовании: позволяет работать с большими популяциями клеток, набирая статистические данные.

Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта
Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3): исследование большой популяции протопластов
АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Максимов и др., 2015. Цитология, 57: 720-26.
Fb
Fg
контроль
10 µМ H2O2
Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым
Максимов и др., 2015

АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
После 10 минут инкубации происходит достоверное смещение популяции в область более отрицательного потенциала.

АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем di-4-ANEPPS: интактные растущие трубки лилии
контроль
500 µM
H2O2
Podolyan et al., 2019

Ca2+
K+
АДФ + Фн
АТФ
H+
Cl-
H2O2
+
+
?
?
Em

В трубке ион-транспортные системы расположены полярно
Они формируют в цитоплазме динамичные градиенты концентраций, а на мембране – градиент МП
АФК-сигнал, приходя в трубку, меняет прямо или косвенно работу практически всех ион-транспортных систем
Тем самым АФК вызывают перестройку внутренних градиентов
NOX
H2O2
АФК как сигнал: H2O2 вызывают перестройку всех градиентов

Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются более 50 белков, которых не было в контроле.
Основные направления: энергетика, метаболизм, синтез белка
Всё для активного роста!
Ни одного антиоксиданта!
АФК как сигнал: протеомика
Данные получены в лабораторией протеомики ИБХ РАН

Цветковые VS Хвойные
Изученный модельный объект
Быстрый рост
Униполярный рост
Обращенный фонтан
Крутой градиент Са2+
Крутой градиент МП
Зависимость от межклеточного взаимодействия
Относительно новый объект
Медленный рост
Возможность биполярного роста
Прямой фонтан
Плавный градиент Са2+
Плавный градиент МП
Больше «автономности»
Цветковые
Хвойные

Градиент мембранного потенциала
табак
ель

Биполярное прорастание у ели
Breygina et al., 2019
(в соавторстве с Полевовой С.В.)

Две трубки, а МГМ один. Куда же он пойдет?
Он тоже сомневается…
b
a
c
d
Биполярное прорастание: ядро

Биполярное прорастание: динамика
2 часа
6 часов
9 часов
Сколько разрывов – столько и трубок
Breygina et al., 2019