Обработка данных секвенирования

Покрытие
Покрытие (глубина секвенирования) – важный параметр методов NGS: кратность прочтения каждого нуклеотида. Для каждой задачи необходимо своё покрытие (обычно устанавливают не менее, чем 30-тикратное покрытие).
Таким образом, “эффективный” объём данных равен выходу секвенирования, делённому на покрытие.

Оценка необходимого покрытия
Вероятность того, что нуклеотид не будет определён (P), исходя из глубины покрытия (c) вычисляется по формуле Ландела–Ватермана:
P=e-c
Теоретически достаточное покрытие должно позволять определить все нуклеотиды в геноме длиной L (P*L<1).
Например, для генома человека (L=3*109 п.о.) теоретически достаточно 23-кратного покрытия

Анализ данных секвенирования
1. Очистка “сырых” данных (raw data) (фильтрация ридов по качеству).
Результат: “примесные” риды удаляются, в остальных обрезаются неточно определённые нуклеотиды
2. Сборка генома (слияние ридов для коротких фрагментов) с помощью специальной программы – ассемблера.
Результат: набор длинных фрагментов (контиги) или их упорядоченная последовательность, образующая скэффолд.
3. Интерпретация данных (аннотация)
поиск кодирующих последовательностей и их структурное и функциональное описание

1. Оценка качества ридов:
FASTQ – формат записи ридов
@SEQ_ID GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65
Каждая последовательность занимает 4 строки:
– первая начинается с @ и содержит название и описание последовательности;
– вторая содержит последовательность (знаки A,G,C,T);
– третья начинается с + и может содержать примечания (технические комментарии секвенирования);
– четвёртая содержит столько же символов, что и вторая, каждый символ указывает вероятность ошибочного определения соответствующего нуклеотида по шкале Phred.

Определение качества ридов по шкале Phred
Каждый символ означает какое-то число (Q) от 0 до 100. Вероятность ошибочного определения нуклеотида (P), качество которого оценивается как Q равна:
P = 10-Q/10
“Хорошее” качество при Q>30 (P<0,001=0,1%)

Phred и ASCII:
номера присваивают начиная с 33 символа (!=0) (Phred+33) или с 64 (@=0) (Phred+64)

Кодировка качества Phred+33

Примеры качества по шкалам Phred+33 и Phred+64

Источники ошибок в ридах: примеси
Примеси бывают:
1. Артефактные (ошибки секвенирования)
образование димеров адаптеров
чтение сквозь – вставки слишком короткие
2. Биологические – контаминация

Источники ошибок в ридах: фазировка
Фрагменты в одном кластере строятся с разной скоростью – секвенатору сложно определить верный нуклеотид.

Программа FastQC – контроль качества ридов:
1. Среднее нуклеотидное качество – хорошее
(все Me>25, все Q1>10)

Программа FastQC – контроль качества ридов:
1. Среднее нуклеотидное качество – неудовлетворительное (есть Me<20 или Q1<5)

Программа FastQC – контроль качества ридов:
2. Средний нуклеотидный состав ридов

Программа FastQC – контроль качества ридов:
2. Средний нуклеотидный состав ридов

Программа FastQC – контроль качества ридов:
3. Чрезмерно представленные последовательности

Очистка “сырых” ридов: тримминг
1. Удаление адаптерных последовательностей из ридов
2. Отсечение с конца ридов нуклеотидов, качество которых ниже определённого уровня (Q<20 или Q<30)
Инструмент для тримминга: программа Trimmomatic

Особый этап для метагеномики – Сортировка данных (биннинг)
1. Методы, основанные на нуклеотидном составе
GC-состав
динуклеотидный состав
тринуклеотидный состав
тетрануклеотидный состав
2. Методы, основанные на гомологии
сравнение с базой данных

2. Сборка генома (assemby)
de novo (сборка не секвенированного ранее генома)
– метод OLC (overlap layout concensus) (перекрытие фрагментов) – для малого количества длинных фрагментов (Sanger)
– графы де Брёйна – для большого количества коротких фрагментов (NGS)
сборка генома, аналогичного ранее собранному (ресеквенирование) референсному геному (выравнивание на геном, alignment)
– хэш-таблицы
– суффиксные деревья

Сборка de novo: Overlap layout consensus: 1
Поиск пар ридов, имеющих общие k-меры (последовательности длиной k, k=24), смещение двух строк относительно друг друга (выравнивание) до максимального совмещения (>95% сходства)

Сборка de novo: Overlap layout consensus: 2
На базе попарного выравнивания строят множественное выравнивание, корректируют ошибки

Сборка de novo: Графы де Брёйна

Результат сборки: контиги и скэффолды

Качество сборки генома
N50 – длина контига, который вместе с остальными контигами большей длины покрывает не менее 50% генома (обычно под геномом понимают суммарную длину всех контигов).
L50 – число контигов не меньших чем N50.
Пример: две сборки генома длиной 5 Mb

Формат представления нуклеотидных последовательностей – FASTA
>OTU-160-1 Acinetobacter baumannii
CCTACGGGGGGCTGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTCTAGTTAATACCTAGGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAA
Каждая последовательность занимает две строки:
1). первая строка начинается со знака > и содержит идентификатор (за которым эта последовательность закреплена в некоторой базе данных), через пробел следует опциональное словесное описание;
2). вторая строка – сама последовательность нуклеотидов.

3. Аннотация
1. Поиск белок-кодирующих последовательностей
на основе гомологии – сравнение с уже известными генами
аннотация ab initio – статистический поиск по характерным для белок-кодирующих участков последовательностям (ATG.....)
2. Поиск других кодирующих последовательностей (гены РНК)