Применение аналитической химии в биоинженерии

Что такое аналитическая химия?
Аналитическая химия — наука, развивающая теоретические основы химического анализа веществ и материалов и разрабатывающая методы идентификации, обнаружения, разделения и определения химических элементов и их соединений, а также методы установления химического состава веществ.

Аналитическая химия имеет огромное научное и практическое значение, представляя совокупность методов исследования веществ и их превращений. Важную роль она играет также и в смежных с химией областях науки – минералогии, геологии, физиологии, микробиологии, а также в медицинских, агрономических и технических науках. Проведение многих научных исследований тесно связано с использованием методов в аналитической химии.

К менее распространенным медицинским исследованиям можно отнести поиск и определение новых маркеров заболеваний, фармакокинетику (изучение миграции и изменений лекарственных веществ в организме), допинг-контроль спортсменов, ДНК-анализы и др.
Целью является обобщение имеющихся данных об анализе биологических тканей и жидкостей, применяемом в медицине, а также выявление основных направлений развития этой области аналитической химии.

Аналитическая химия довольно длительное время не уделяла внимания медицинским и биологическим объектам. Методический уровень медико-биологических исследований, которыми занимались врачи или биологи, с точки зрения профессионала-аналитика был (а иногда и остается) довольно низким. В конце XX века в исследования медицинского назначения включается все больше и больше аналитических лабораторий. Этот процесс особенно характерен для США, где на биомедицинские исследования выделяются огромные средства. За это время были разработаны новые методы, прежде всего, метод иммуноанализа. В журналах по аналитической химии постоянно растет число публикаций, посвященных исследованию медицинских объектов.

Что такое БИОИНЖЕНЕРИЯ?
Биоинженерия (включая инженерию биологических систем) -- это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики) для решения актуальных проблем связанных с науками о живых организмах и/или их приложениями, с использованием аналитических и синтетических методологий инженерного дела, а также его традиционной чувствительности к стоимости и практичности найденных решений.

Сфера деятельности биоинженерии
Биоинженерия простирается от создания искусственных органов с помощью технических средств или поиска способов выращивания органов и тканей методами регенеративной медицины для компенсации пониженных либо утраченных физиологических функций (биомедицинская инженерия) и до разработки генетически модифицированных организмов, например, сельскохозяйственных растений и животных (генетическая инженерия), а также молекулярного конструирования соединений с заданными свойствами (белковая инженерия, инженерная энзимология). В немедицинских аспектах биоинженерия тесно соприкасается с биотехнологией.

Методы аналитической химии позволяют ответить на многие вопросы, возникающие при осаждении нуклеиновых кислот в водном растворе (находит частое применение в биоинженерии), что необходимо для определения чистого ДНК, а потом и РНК. Рассмотрим методики полностью.

Методы исследования первичной и вторичной структуры нуклеиновых кислот.
1.Выделение ДНК и РНК2Физикохимические свойства ДНК;
2.Физико‐химические свойства ДНК;
3.Методы анализа первичной структуры ДНК;
4.Методы анализа вторичной структуры ДНК;
5.Методы гибридизации ДНК.

1.Этапы выделения ДНК и РНК

Как мы видим, методы аналитической химии помогают при отделении нуклеиновых кислот. Мы оцениваем обстановку с помощью спектрофотометрии.

Спектрофотометрия. Сущность метода.
Это метод фотометрического анализа, в котором определение содержания вещества производят по поглощению им монохроматического света в види­мой, УФ- и ИК-областях спектра. В спектрофотометрии, в отличие от фото­метрии, монохроматизация обеспечивается не светофильтрами, а монохроматорами, позволяющими непрерывно изменять длину волны. В качестве монохроматоров используют призмы или дифракционные решетки, которые обеспечивают значительно более высокую монохроматичность света, чем светофильтры, поэтому точность спектрофотометрических определений выше.

Задачи спектрофотометрии
Спектрофотометрические методы, по сравнению с фотоколориметрическими, позволяют решать более широкий круг задач:
- проводить количественное определение веществ в широком интервал длин волн (185-1100 нм);
- осуществлять количественный анализ многокомпонентных систем (одновременное определение нескольких веществ);
- определять состав и константы устойчивости светопоглощающих комплексных соединений;
- определять фотометрические характеристики светопоглощающих соединений.
Фотометрическим методом можно определять также компоненты смеси двух и более веществ.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Секвенирование — это метод определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Тестирование используется для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностей организма. Существует несколько разновидностей секвенирования, которые позволяют выявлять возможные генетические отклонения и редкие генетические варианты, тонко влияющие на появление определенных патологий в человеческом организме.

Один из наиболее популярных методов секвенирования обязан своим появлением английскому биофизику Фредерику Сэнгеру (1918–2013) — единственному ученому в истории мировой науки, получившему сразу две Нобелевские премии по химии (в 1958 и 1980 годах). Первую премию присудили за установление структур белков, особенно инсулина, а вторую награду ему вручили в том числе и за разработку методов определения первичной последовательности нуклеиновых кислот.
Методику секвенирования ДНК с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов и ДНК-полимеразы (или фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I) предложили Сэнгер и его коллеги в 1977 году, причем с течением времени этот метод прошел несколько модификаций и к настоящему моменту считается золотым стандартом современного секвенирования.

Секвенирование ДНК – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.
Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо (в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы) при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, т.е. разрушают водородные связи, получая отдельные нити. Затем к ДНК присоединяют так называемые праймеры; это короткие участки ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза – соединение, которое, собственно, и занимается копированием (репликацией) нити ДНК.
Схематическое изображение процесса репликации ДНК: (1) Отстающая цепь (запаздывающая нить), (2) Ведущая цепь (лидирующая нить), (3) ДНК-полимераза α (Polα), (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) Праймаза, (7) Фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза δ (Polδ), (9) Хеликаза, (10) Однонитевые ДНК-связывающие белки, (11) Топоизомераза.

Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез (КЭ) - интенсивно развивающийся метод разделения сложных смесей, позволяющий анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью.
В основе капиллярного электрофореза лежат электрокинетические явления — электромиграция заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и т. п., в капилляре существенно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений.

Разделение пробы достигается приложением напряжения к буферным сосудам. Возникающее в капилляре электрическое поле вызывает миграцию зоны пробы. На электрофоретическое перемещение всегда накладывается более или менее интенсивный электроосмотический поток (ЭОП), который способствует пассивному транспорту зоны пробы, а не ее разделению. Этот ЭОП сильно зависит от значений рН буфера и от свойств поверхности капилляра. Он может быть настолько большим, что будут двигаться не только нейтральные молекулы, но даже отрицательно заряженные ионы могут перемещаться к детектору, несмотря на их электрофоретическую миграцию.
Измерение pH буферного раствора выполняют с помощью двух потенциометров разных типов.

ПОТЕНЦИОМЕТРИЯ
Потенциометрический метод анализа основан на зависимости равновесного электродного потенциала (Е) от активности (a) или концентрации (С) вещества в растворе.
Для измерений необходимо составить гальванический элемент из подходящего индикаторного электрода и электрода сравнения, а также иметь прибор для измерения потенциала индикаторного электрода. В качестве таких приборов используют:
потенциометр (для особо точных измерений);
электронные вольтметры, рН-метры. Иономеры - современные потенциометры заводского типа с электронными усилителями тока. Выпускаются серийно. Шкалы калиброваны: мВ, ед. рН, ед. рХ.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.

Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.

Типичная реакционная смесь
Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки сойдет даже суспензия клеток. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.
Праймеры. Праймер — это искусственно синтезированная короткая цепочка нуклеотидов (15–30 штук), комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров, как и у любого олиго- или полинуклеотида, есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.
Нуклеотиды. А точнее, дезоксинуклеотидтрифосфаты — четыре вида «кирпичиков» для строительства цепей ДНК: дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ.
ДНК-полимераза. Фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза) и Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза). Первая — самая производительная, а две другие — более точные.
Буфер. Раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.

Этапы ПЦР

Аппаратура для ПЦР

Визуализация продуктов ПЦР
Для того, чтобы проверить качество и количество продуктов ПЦР, как правило, используют метод агарозного гель-электрофореза. Для этого достаточно взять около 10 микролитров продуктов ПЦР, внести в лунку агарозного геля и посмотреть на результат разделения в ходе электрофореза.

Только в одном длительном процессе (секвенирование) мы установили два метода аналитической химии и физико-химических методов анализа:
1) Спектрофотометрия;
2) Потенциометрия.
Вследствие вышеуказанного мы можем сделать вывод о значимости методов аналитической химии, ведь , в данном процессе (секвенирование) , необходимо постоянно контролировать процесс, чтобы не ошибиться и не переделывать все заново.