Иммуноблотинг (син. вестернблотинг)

Иммуноблотинг (син. вестернблотинг) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод выявления белков, основаный на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело».
Метод иммуноблотта как правило, необходим после обнаружения положительных антител класса IgG инфекционного процесса, т.к. именно в такой комбинации происходит более правильная лабораторная интерпретация результатов и дальнейшая тактика лечения пациента.

Имунноблотинг
Вестерн-блот: Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.
Лайн-блот. Это дифференциальная диагностика нескольких инфекций на одном стрипе.

Иммуноблоттинг применяется
в диагностике заражений и инфекций вирусами:ВИЧ, коронавирус,вирус простого герпеса (HSV), гепатита В, С.
можно диагностировать некоторые паразитические болезни, а также генетические заболевания.
возможно проведение подробного анализа антигенспецифических-IgE (АС-IgE) к различным компонентам сложных аллергенов.

Подготовка образца
Образец из цельной ткани или из клеточной культуры.
Твёрдые ткани сначала измельчаются механически с использованием гомогенизатора или обработки ультразвуком.
Различные детергенты, соли и буферы применяются для улучшения лизиса клеток и растворения белков.
Ингибиторы протеаз и фосфатаз добавляются для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами.
Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.

Этапы иммуноблоттинга
1. Разделение белков методом гель-электрофореза
2. Перенос белков на мембрану
3. Блокирование
4. Детекция

Разделение белков методом
гель-электрофореза.
Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS) по методу Лэммли.
Подлежащие анализу белки в присутствии додецилсульфата натрия приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы.

Установка электрофореза
Результат разделения белков

Перенос белков на мембрану.
В методе электроблоттинга перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида происходит под действием электрического тока.
Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны и доступны для дальнейшего связывания с антителами.
Эффективность электроблоттинга значительно повышается при использовании системы Транс-блот Turbo, позволяющей существенно уменьшить время переноса белков из геля на ме мбрану (7мин против 2 часов).

Блокирование
Блокирование неспецифичных связываний достигается инкубацией мембраны в разбавленном растворе белка — обычно бычьего сывороточного альбумина или обезжиренного сухого молока с небольшим процентом детергента типа Tween 20 или Triton X-100.
Блокирование позволяет достигать чистого фона и исключает получение ложноположительных результатов.

Отмывка
После блокировки мембрану 3х-кратно промывают буфером

Детекция
Исследуемые белки детектируют с использованием антител методом «сэндвича»:
сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами
затем связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами.

Наиболее распространенные вторичные антитела , связанные с пероксидазой хрена.
Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который дает излучение в ближней инфракрасной области
Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента