Изучение влияния метки коллоидного золота на способность антител взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса картофеля (ХВК)

Целью исследования было изучение влияния метки коллоидного золота на способность антител взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса картофеля (ХВК) и вируса табачной мозаики (ВТМ).

Задачи:
Изучить взаимодействие вирусов с нативными препаратами антител.
Изучить взаимодействие вирусов и конъюгатов антител с коллоидным золотом.
Охарактеризовать изменения взаимодействия антител с вирусами при их иммобилизации на поверхности коллоидного золота.

Гипотеза
Иммобилизация антител на коллоидном золоте происходит преимущественно по участкам их поверхностей, не входящим в антиген-связывающие сайты.
Поэтому антитела при иммобилизации
не теряют
функциональности.
Общий план строения антител: 1) Fab;
2) Fc; 3) тяжелая цепь; 4) легкая цепь;
5) антиген-связывающий участок;
6) шарнирный участок

В работе использовались
Х-вирус картофеля (ХВК)
Вирус табачной мозаики (ВТМ)
Моноклональные антитела против ХВК и ВТМ
Коллоидное золото
Конъюгат коллоидного золота с антителами
Конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
Метод электронной микроскопии
Метод атомно-силовой микроскопии
Метод иммуно-хроматографического анализа.

Проверка взаимодействия немодифицированных антител с вирусами с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)
Схематическое изображение образования иммунных комплексов при проведении ИФА: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – конъюгат антитела с пероксидазой хрена, 4 – антитело
Фотография микропланшета

Концентрационная зависимость взаимодействия антител с иммобилизованным ВТМ в системе ИФА

Выводы по ИФА взаимодействия моноклональных антител с ВТМ
Количество иммунных комплексов, регистрируемых методом ИФА, зависит от концентрации и антител и вируса, что позволяет проводить выбор антител, наиболее эффективно взаимодействующих с вирусом.
Из трех охарактеризованных антител против ВТМ для дальнейшей работы было выбрано 3G11, связывание которого регистрируется в концентрации до 20 нг/мл.

Получение и характеристика коллоидного золота
Гистограмма распределения
частиц по диаметру
Электронно-микроскопическая фотография препарата коллоидного золота
3D-изображение препарата
коллоидного золота
(атомно-силовая микроскопия)

Получение конъюгатов коллоидного золота с антителами.
Диализ антител
Определение концентрации антител по оптической плотности при длине волны 280 нм
Определение оптимальной концентрации антител для получения стабильных неагрегирующих конъюгатов с КЗ
Синтез конъюгатов
Спектрофотометри-ческая характеристика конъюгата
Схематическое изображение конъюгата коллоидного золота (2) с антителами (1)

Проверка работы конъюгата с помощью иммунохроматографического анализа

Проверка взаимодействия вирусов и конъюгатов антител методом ИФА
Схематическое изображение образования иммунных комплексов: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – антитела, 4 – частица коллоидного золота, 5 – конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.

ИФА взаимодействия ВТМ и немодифицированных
антител
ИФА взаимодействия ВТМ и конъюгатов коллоидного золота с антителами
Сравнение взаимодействия с ВТМ немодифицированных
антител и конъюгатов коллоидного золота с антителами

Вывод
Антитела, специфичные к вирусам (ХВК и ВТМ), не теряют функциональности при иммобилизации на частицах коллоидного золота. При этом уровень связывания в системе ИФА выше для конъюгированных с коллоидным золотом антител, чем для немодифицированных антител в той же концентрации. Таким образом, наша гипотеза полностью подтвердилась.

Используемая литература
Вершигора А.Е. Общая иммунология. // К.: Выща шк. 1989. С. 101.
Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: Нива России. 2000. С. 48-74.
Feinstein A., Rove A.J. Molecular mechanism of formation of an antigen-antibody complex. // Nature. 1965. V. 4967. P. 147-149.
Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк. 1991. С. 20-25.
Антитела. Ред. Кэтти Д., М.: Мир. 1991. Т. 1. С. 11-30, 39, 105-111.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ.- М.: Мир, 2002. С. 210-222
Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. С. 124-127.
Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Ж.Н., Чередникова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного определения гербицидов симазина и атразина. Прикладная биохимия и микробиология. 1995 т. 31, N 1, сс. 134-139.

Благодарности
Я благодарю сотрудников лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха, в частности моего научного руководителя, Ирину Викторовну Сафенкову, за помощь в работе, а так же Сергея Менделевича Глаголева за организацию биопрактики.

Имунноферментный анализ
Первый столбец лунок оставлен под контроль, а в остальные добавлено по 100 мкл раствора вируса в ФБ (фосфатный буфер) (для каждой – по две строки).
Первый столбец был оставлен под контроль, в следующие раститрованы антитела (по три столбца на каждое антитело) 3G11, 3G1, 2C12. В последние два столбца ничего не добавляли.

(рН 8,5) IgG-11G (mg/ml) = [(A(280)*10]/1,4= [0,091*10]/1,4 = 0,65 mg/ml