Абсорбционная спектроскопия

Методы, используемые в биологической химии
Биохимия на всем протяжении своего раз-
вития была и остается экспериментальной
наукой.
Успех любого исследования определяется
главным образом правильным выбором экс-
периментального подхода к научной пробле-
ме и корректныи использованием выбран-
ных методических приемов.
В биохимии используются практически
все современные методы физико-химичес-
кого анализа.

УФ и видимый диапазоны спектра
Видимая область спектра
ИК-область
Ультрафиолет
400 нм
750-760 нм
200 нм
280 нм
315 нм
С
B
A
С – поддиапазон: полностью задерживается озоновым слоем в стратосфере
на высоте около 50 км.
В – поддиапазон: поверхности земли достигает около 10% исходного.
А – поддиапазон: достигает поверхности земли. Только этот поддиапазон
УФ вызывает фотоэффекты у живых объектов, необ-
ходимые для процессов их жизнедеятельности.
800 нм

Абсорбционная спектроскопия в УФ и видимой
областях спектра служит для:
Высокочувствительного качественного анализа
сложных смесей веществ.
- Высокочувствительного количественного анализа.
Изучения структуры веществ, а также для оценки
её изменений в различных условиях.
Достоинства:
Изучаемые вещества не разрушаются.
Высокая чувствительность методов.
Высокая специфичность методов.
Возможность обнаружения низких концентраций
веществ в составе сложных смесей без их пред-
варительного разделения.

Энергия любого вида электромагнитного излучения (в том числе и светового) поглощается и излучается отдельными порциями. Эти порции энергии обладают свойствами материальной частицы и называются квантами излучения или фотонами.
Энергия кванта (фотона):
Е = h x ν
h – постоянная Планка
- частота, Гц
Энергия кванта прямо пропорциональна частоте (ν)
и обратно пропорциональна длине волны (λ).

Взаимодействие кванта (фотона)
с веществом
Квант светового излучения не взаимодействует с веществом.
При этом энергия кванта не поглощается веществом, квант
изменяет свое направление – происходит рассеивание свето-
вого излучения.
2. Квант светового излучения поглощается веществом. Это обу-
словлено тем, что сама молекула (функциональная группа в
составе молекулы) является хромофором. Именно хромофор
поглощает энергию кванта.
Хромофор поглощает только те кванты, энергия которых равна
разнице энергий электронов хромофора в его основном и воз-бужденном состояниях:
hν = Ee-возб. сост. - Ee-осн. сост.
Этим объясняется феномен: разные вещества (хромофоры)
поглощают световые излучения с разной длиной волны (λ).

Основное и возбужденное
состояния вещества
Основное (невозбужденное) состояние веще-
ства (So) – вещество не поглощает и не излучает энер-
гию.
Когда вещество поглощает квант энергии – происхо-
дит его переход в возбужденное (S1) состояние.
S – синглетное состояние (спин е- не меняется)
hν
тепло
So
S1
Электроны переходят с орбита-
лей нижних энергетических уров-
ней на орбитали с высоким энер-
гетическим уровнем (спин е- со-
храняется).
S1 – состояние длится 10-8 -10-9 с
В растворе возбужденная молекула соударяется
c другими молекулами с частотой 10-12 с, теря-
ет энергию и возвращается в состояние So.

Поглощение светового излучения средой описывает закон Ламберта-Бугера-Бэра
ФЭ
Io
I
Io > I
%T (светопропускание) = I x 100% / Io
Е, А, D (экстинкция, оптическая плотность) = lg Io/ I
Закон выражает связь между E и С:
E = ε x C x l
C – mol/l; l – толщина слоя, см; ε − молярный коэффициент
экстинкции
Как измерить интенсивность прошедшего светового потока?
Исходный световой поток
Прошедший световой поток

Зависимость оптической плотности (экстинкции)
от концентрации поглощающего вещества в
растворе
Оптическая
плотность (D, E)
Концентрация, С
При неизменной толщине слоя – прямая,
выходящая из начала координат
tg угла наклона - ε
Cк
Отрицательное
отклонение
от закона
Ламберта – Бугера-Бэра

Основные причины отклонений
от закона Ламберта – Бугера-Бэра
реакции ассоциации, диссоциации или химичес-
кие взаимодействия соединения с растворите-
лем;
флуоресценция анализируемого вещества в
растворе. Весь вторичный световой поток попа-
дает на фотоэлемент. При большой толщине
слоя – происходит тушение флуоресценции;

немонохроматичность падающего на образец
света (Io) при большой ширине спектральной
щели. При этом могут быть существенные отличия
в распределении интенсивности световых пучков с
разной λ. Это особенно сильно проявляется у
веществ с очень узким диапазоном поглощения.
Для устранения возможной ошибки выбирают ши-
рину спектральной щели < полуширины исследу-
емой полосы (1/2 Δλ);
присутствие рассеянного и/или отраженного света
(дефекты призм, зеркал, пыль и тд.);
неисправность фотоэлемента, усилителя прибора.

Eλ
λ
Δλ
Ширина спектральной щели < ½ Δλ
Δλ − ширина полосы поглощения

Спектр поглощения
Спектр поглощения (абсолютный спектр поглоще-ния) – зависимость количества поглощенного света от длины волны.
У каждого вещества спектр поглощения уникален – это его «молекулярный паспорт».
Спектры поглощения Hb (I), окси-Hb (II) и
карбокси-Hb (III)
Поглощение гема идет в обл. 400 нм – поло-
са Соре. Окси-Hb при: ~414 и 543 нм;
карбокси-Hb при: 420 и 560 нм.
Точные положения пиков
поглощения уникальны для
различных видов животных.

Спектр поглощения окисленной (I) и восстановленной
(II) форм пиридиновых нуклеотидов (НАД и НАДФ).
Поглощение при λ 260 нм обусловлено
адениновым кольцом. Для восстанов-
ленной формы характерно снижение
поглощения при 260 нм и появление
интенсивного поглощения при 340 нм.
Окисленная форма поглощает
только при 260 нм.

Аппаратура для абсорбционной спектроскопии
Фотоколориметр (фотометр, колориметр):
Единственный источник света
Спектральный диапазон: λ 315 – 700 нм
λ задается светофильтрами (иногда дифракционной
решеткой)
Светофильтр выделяет полихромный световой поток
Для измерений используют кюветы из оптического
стекла
2. Спектрофотометр:
Для УФ и видимой областей – отдельные источники света
Спектральный диапазон: λ 200 – 1000 нм
λ задается монохроматором
Монохроматор выделяет монохромный световой поток
Для измерений в УФ-диапазоне используются кюветы из
кварцевого стекла.

Область применения абсорбционной спектроскопии:
Измерение С вещества в растворе (количественный
анализ);
2. Регистрация течения химических превращений;
3. Идентификация веществ в растворе (спектр поглоще-
ния – «молекулярный паспорт» вещества – качествен-
ный анализ);
4. Регистрация изменений физико-химических свойств
молекул (денатурация-ренатурация ДНК) и т.д.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
(ФЛУОРИМЕТРИЯ)

Флуориметрия
Флуоресценция – испускание света молекулой,
возбужденной световым излучением. (Свечение мо-
лекул также можно инициировать химической реакци-
ей – хемилюминесценция).
Некоторые вещества содержат в своем составе
функциональные группы – флуорофоры, которые
поглощают кванты возбуждающего светового излу-
чения и обеспечивают флуоресценцию – испускание
вторичного светового излучения (вторичного свето-
вого потока).
Полагают, что для флуорофорной группы характер-
но наличие асимметричного атома углерода.
Флуориметрия – регистрация интенсивности вторич-
ного светового излучения (потока).

Природа флуоресценции
ЭНЕРГИЯ ЭЛЕКТРОНОВ
Основное состояние, So
S1, первое
возбужд.
состояние
S2, второе
возбужд.
состояние
+ hν
Потеря части энергии
за счет взаимостолкновений,
Т = 10-15 с
Излучаемые hν,
вторичное излучение
Энергия излучаемого hν
всегда меньше энергии
возбуждающего hν
Испускают оставшуюся
энергию в виде вторичного
излучения, Т = 10-8 с
So
S2
S1

Спектры возбуждения и спектры флуоресценции
Спектр возбуждения - зависимость количества
поглощенного света от длины волны (то же, что
спектр поглощения).
Спектр флуоресценции – интенсивность флуо-ресценции (Iф), измер. при различных длинах волн.
Е, Iф
Возб.
Возб.
Флуор.
Флуор.
сдвиг Стокса
Сдвиг Стокса – энергия кванта флуоресценции всегда меньше энергии кванта возбуждения –
- mах. флуоресценции сдвинут в
длинноволновую область

Основные закономерности флуоресценции
Флуоресценция происходит при любой длине
волны возбуждающего света.
2. Q (квантовый выход флуоресценции):
число квантов флуресценции
Q =
число поглощенных квантов
3. Закон Вавилова: Q не зависит от длины волны
возбуждающего света.

Зависимость Iф от концентрации вещества
Iф = Io x Q x C
Io – интенсивность возбуждающего света;
Q – квантовый выход;
С – концентрация вещества
Флуоресцентный анализ на порядок чувствитель-
ней, чем спектрофотометрия. Для соблюдения
линейной зависимости Iф от С, содержание флу-
орофора в кювете не должно превышать 5% от
её объема.

Для того, чтобы в полной мере реализовать высо-
кую чувствительность, свойственную флуориметрии,
необходимо:
возбуждать флуоресценцию при максимуме погло-
щения;
регистрировать флуоресценцию при длине волны,
при которой интенсивность флуоресценции макси-
мальна.
Для количественно анализа требуется калибровоч-
ный график (Iф от С) или раствор стандарта (раствор
флуорофора с известной концентрацией).

Устройство спектрофлуорметра
(вид сверху)
Монохроматор 1
Выделяет λ, которая
максимально
поглощается
веществом
Монохроматор 2
Выделяет λ, при
которой Iф
максимальна
λ возб.
λ флуор.
ФЭ
Две лампы
для УФ и видимой
обл. спектра
Кювета с
образцом
Вторичное
излучение –
- флуоресценция

Применение флуориметрии
Высокочувствительный и высокоспецифичный количествен-
ный анализ (в том числе, в энзимологии).
Качественный анализ – спектры возбуждения и флуресценции
уникальны.
3. Возможность работы с суспензиями живых клеток и субкле-
точных структур (мутность пробы не имеет значения).
Главное – избегать условий, при которых происходит тушение
флуоресценции.
4. С использованием флуоресцентных зондов и меток – можно
изучать структуру биомолекул, свойства биомембран, оцени-
вать трансмембранный потенциал, активность транспортных
и др. процессов и состояний.

СВЕТОРАССЕИВАНИЕ

Методы, основанные на измерении светорассеивания
Светорассеивание, обусловленное частицами, взвешенными в
растворе (преципитат в результате взаимодействия антигена и
антитела).
1
Теория светорассеивания разработана Рэлеем: Iр =
λ4
А. Dчастицы < 1/10 λ Б. Dчастицы > 1/10 λ В. Dчастицы > λ
Io
I
Io
Ip
I
I
Io
Ip
Ip
Ip
Рассеивание
идет
симметрично
Рассеивание
идет не сим-
метрично
Рассеянный свет
почти совпадает
с прошедшим
Ip

Турбидиметрия (англ. «turbidity» – мутность).
Метод основан на измерении интенсивности про-шедшего через образец (не рассеянного) света.
Реализуется с помощью обычного фотометра.
Выбирают светофильтр, обеспечивающий световой поток с минимальной λ. Метод эффективен, если
образец рассеивает не менее 10% от величины Io.
2. Нефелометрия.
Метод основан на измерении интенсивности рассеянного образцом света. Метод более чувстви-
телен, чем турбидиметрия, реализуется с помощью
специального прибора – нефелометра. Через обра-зец пропускают свет с λ = 600-700 нм (при большой λ
шире диапазон D частиц, рассеивающих свет).

Пламенная фотометрия
Эмиссионная
пламенная
фотометрия
Регистрация интенсивности
излучения пламени
при определенной λ
Абсорбционная
фотометрия
пламени
Регистрация поглощения
пламенем проходящего
через него излучения
с определенной λ
Соли металлов, сгорая в пламени (Т >1500o C), совершают пере-
ход: основное состояние ?? возбужденное состояние. Эти яв-
ления лежат в основе:
Испускания пламенем излучения с определенной λ.
Поглощения пламенем проходящего через него излучения с
определенной λ.

Эмиссионная пламенная фотометрия – пламенный фотометр
МХ
Газ (смесь газов)
эжектор
Iλ
Анализируемый материал разводят в 50-100 раз
для обеспечения стандартного размер частиц
получаемого аэрозоля.
аэрозоль
Монохроматор выделяет световой
пучёк, который образует искомый
микроэлемент
ФЭ
Эмиссия пламени

Абсрбционная фотометрия пламени– пламенный фотометр
газ
эжектор
Iо
аэрозоль
Поглощение пламенем происходит
в очень узком диапазоне спектра
ФЭ
I
Лампа специальной конструкции - позволяет
получать излучение с λ, характерной для
искомого микроэлемента. Для каждого микро-
элемента – индивидуальная лампа.