Альтернативный сплайсинг – детская площадка эволюции

Оценки % альтернативно сплайсируемых генов млекопитающих (по году публикации)
Человек (выборка из генома)
Человек (полные хромосомы)
Мышь (выборка из генома)
Все гены
Только гены с ≥2 экзонами
Гены с высоким покрытием EST

Значение альтернативного сплайсинга
Функциональное:
поддержание белкового разнообразия
Человек: ~30.000 генов, >100.000 белков
поддержание белкового единообразия
Например, секретируемые, мембранные и цитоплазматические изоформы
регуляция?
Эволюционное

Эволюция альтернативной экзон-интронной структуры
млекопитающие: человек, мышь, собака
двукрылые насекомые: Drosophila melanogaster, D. pseudoobscura, Anopheles gambiae
Скорость эволюции и тип отбора в постоянных и альтернативных областях
Человек и мышь
D. melanogaster и D. pseudoobscura
человек-шимпанзе vs. человеческие SNP
Альтернативный сплайсинг и структура белка
Общий план

Элементарные альтернативы
Кассетный экзон
Альтернативный донорный сайт
Альтернативный акцепторный сайт
И т.д.: взаимоисключающие экзоны,
удержанные интроны, сложные альтернативы

EDAS: альтернативный сплайсинг генов человека
20809 генов;
114568 мРНК;
91835 белков;
51713 альтернатив,
из них 31746 элементарных

Альтернативная экзон-интроная структура генов млекопитающих
Тройки ортологичных генов: человек-мышь-собака
Следим за судьбой (консервативностью) альтернатив человека в геномах мыши и собаки

Потеря альтернативы в геноме мыши
общий
предок

Потеря альтернативы в геноме собаки
(хотя теоретически возможно возникновение в общем предке приматов и грызунов)
общий
предок

Появление альтернативы в геноме человека (или ошибка сплайсинга, или экспериментальный шум)
Common
ancestor

Неконсервативные
альтернативы человека:
шум?
Консервативные
альтернативы
Альтернативы в генах человека, отсутствующие в генах мыши – реальны ли они?

Human-specific alternatives:
noise?
Conserved
alternatives
Добавим геном собаки
Консервативные
альтернативы
потери у собаки
потери у мыши
Неконсервативные
альтернативы человека:
шум?

Наблюдения
Часто вставляемые экзоны консервативны независимо от того, сбивают ли они рамку
Редко вставляемые экзоны менее консервативны, особенно сбивающие рамку
Много геном-специфичных потерь
Больше в мыши, чем в собаке
Чаще для экзонов, сбивающих рамку
Тем не менее, ~40% редко вставляемых экзонов консервативны хоть в одном экзоне
нет сдвига рамки
сдвиг рамки

Консервативность белок-кодирующих областей в генах насекомых
Технически сложнее (сложности с выравниванием), но наблюдения те же: альтернативные сегменты менее консервативны, чем константные

Консервативность элементарных альтернатив D.melanogaster в генах D. pseudoobscura
голубой – сохранились точно
зеленый – вставка интрона в D.ps. (или потеря в D.mel.)
желтый – вставка интрона в D.mel.(млм потеря в D.ps.)
oранжевый – множественные вставки/потери
красный – неконсервативно
Удержанные интроны наименее консервативны (все ли они функциональны?)
Взаимоисключащие экзоны столь же консервативны, как конститутивные

Консервативность элементарных альтернатив D.melanogaster в генах Anopheles gambiae
голубой – сохранились точно
зеленый – вставка интрона в Anopheles (или потеря в Drosophila)
желтый – вставка интрона в Drosophlia (млм потеря в Anopheles)
oранжевый – множественные вставки/потери
красный – неконсервативно
~30% вставок у дрозофилы, ~10% вставок у комара (вообще, у него примерно 3 интрона на ген, а у дрозофилы примерно 4)
Почти нет вставок интронов во взаимоисключающие экзоны

Скорость эволюции и тип отбора в альтернативных и константных областях
Пары ортологичных генов
человек и мышь
D. melanogaster и D. pseudoobscura
Отношение скорости синонимичных и несинонимичных замен (dn/ds):
большая доля несинонимичных замен (изменяющих аминокислоту)
=> слабый стабилизирующий отбор или отбор на изменчивость
(в такой постановке неразличимы)

Гены человека и мыши:
несимметричная гистограмма
dn/ds(const)–dn/ds(alt)
Черный: «тень» левой части.
В большей части генов dn/ds(alt) > dn/ds(const), особенно в области больших значений. Т.е. в альтернативных областях слабее стабилизирующий отбор

Гены Drosophila:
слабее отбор в альтернативных областях?
Больше замен в альт. обл.
Равный уровень замен
Больше замен в конст. обл.
В большинстве генов, уровни и синонимичных, и несинонимичных замен выше в альтернативных областях по сравению с конститутивными

Альтернативные области изменяются быстрее, чем константные
dN
dN/dS
dS
dN/dS
dS
dN
1
0

Ослабление стабилизирующего отбора в альтернативных областях
dN/dS
dN
dS
dN/dS
dS
dN
1
0

Положительный отбор во внутренних альтернативных областях генов Drosophila
dN/dS
dS
dN
dN(AI)/dS(AI) = 1,43
1,5
0

Тест МакДональза-Крейтмана: положительный отбор в минорных альтернативных областях
Сравнение различий между генами человека и шимпанзе со SNP человека
Экзоны, консервативные в генах мыши и/или собаки
Гены с ≥60 ESTs
Оценка значимости – тест Фишера
Минорные изоформы:
Больше несинонимичных SNP: Pn(alt_minor)=.12% >> Pn(const)=.06%
Больше несинонимичн. замен: Kn(alt_minor)=.91% >> Kn(const)=.37%
Положительный отбор (не просто ослабление стабилизирующего):
α = 1 – (Pa/Ps) / (Ka/Ks) ~ 25% позиций
Аналогичные результаты для всех консервативных альтернатив или для всех генов с высоким покрытием EST

Попытка синтеза
Альтернативный сплайсинг часто видоспецифичен
«молодые» альтернативные изоформы часто тканеспецифичны
… но все же функционален
В альтернативных областях снижен уровень стабилизирующего отбора
избыток несинонимичных замен (по сравнению с синонимичными)
В альтернативных областях действует положительный отбор
избыток несинонимичных замен (по сравнению с SNP)
Альтернативный сплайсинг часто тасует белковые домены
Таким образом, альтернативный сплайсинг – это способ попробовать новые формы белков, не жертвуя старыми

Планы: много дрозофил;
млекопитающие (ENCODE)

Что делать?
Оценить не только скорость потерь альтернатив, но и скорость приобретений (отличая молодые изоформы от ошибок сплайсинга)
Следить за:
функциональность: транслируемые / нарушающие рамку
уровень: частые / редкие изоформы
паттерн тканеспецифичности (?)
Тип альтернативы: N-концевая / внутренняя / C-концевая
Альтернативный сплайсинг в одном геноме / конститутивный – в другом (данные с микрочипов)
Эволюция регуляции альтернативного сплайсинга
Ошибки сплайсинга и мутации:
удержаные интроны, пропущенные экзоны, скрытые сайты

Благодарности
Обсуждения
Евгений Кунин (NCBI)
Игорь Рогозин (NCBI)
Всеволод Макеев (ГосНИИГенетика)
Дмитрий Петров (Stanford)
Дмитрий Фришман (GSF, TUM)
Данные
King Jordan (NCBI)
Поддержка
РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»)
РФФИ
Howard Hughes Medical Institute
INTAS

Авторы
Андрей Миронов (МГУ, ИППИ)
Рамиль Нуртдинов (МГУ)
– человек/мышь/собака
Дмитрий Малько (ГосНИИГенетика)
– дрозофилы/комар
Екатерина Ермакова (ИППИ)
– Kn/Ks
Василий Раменский (ИМБ)
– SNP
Ирена Артамонова (ИОГен)
– человек/мышь, график из обзора
Алексей Неверов (ГосНИИГенетика)
– функциональность изоформ

Основные публикации
10,1 D.B.Malko, V.J.Makeev, A.A.Mironov, M.S.Gelfand (2006) Evolution of the exon-intron structure and alternative splicing in fruit flies and malarial mosquito genomes. Genome Research. 16: 505-509 .
4,1 E.O.Ermakova, R.N.Nurtdinov, M.S.Gelfand (2006) Faster evolutionary rate in alternatively spliced regions of mammalian genes. BMC Genomics. 7: 84.
0,36 Е.О.Ермакова, Д.Б.Малько, М.С.Гельфанд (2006) Эволюционные отличия альтернативных и постоянных белок-кодирующих участков альтернативно сплайсируемых генов Drosophila. Биофизика. 51: 581-588.
0,36 Р.Н.Нуртдинов, А.Д.Неверов, Д.Б.Малько, И.А.Космодемьянский, Е.О.Ермакова, В.Е.Раменский, А.А.Миронов, М.С.Гельфанд (2006) EDAS – база данных альтернативно сплайсированных генов человека. Биофизика. 51: 589–592.
книга A.D.Neverov, A.A.Mironov, M.S.Gelfand (2006) Similarity-based gene recognition. Handbook of Computational Molecular Biology (Chapman & Hall/CRC), Chapter 2.
книга M.S.Gelfand (2006) Computational analysis of alternative splicing. Handbook of Computational Molecular Biology (Chapman & Hall/CRC), Chapter 16.
В работе:
Nurtdinov et al. Conserved and species-specific alternative splicing in mammalian genomes
Ramensky et al. Positive selection in alternatively spliced regions of human genes