Экспрессия чужеродных генов и системы трансформации

Что такое трансформация?
Это введение ДНК неполовым путем в клетку реципиента, проводящее к наследуемому изменению генотипа
Основной метод биотехнологии растений и мощнейшая экспериментальная методика
Убирает барьеры по переноске генов
Развитие трансформации E.coli, а также разрезание и сшивание ДНК in vitro дало начало генетической революции в 70-е годы
Не надо путать с генетической трансдукцией, представляющей собой частный случай пепеноса генов между хозяином и вирусом

Некоторые примеры:
Секвенирование геномов четко показало, что у бактерий существует горизонтальный перенос генов между разными видами при определенных селектинвых преимуществах (условиях отбора)
Формирование раковых клеток у животных под действием онкогенных вирусов, таких как SV40 и аденовирусов. Часть вирусной ДНК интегрируется в ДНК хозяина и вызывает неконтролируемый рост клеток (в биологии рака существует свое более узкое определение трансформации)
3. У растений, такких как бананы, табак и кокос tobacco, малые ДНК-вирусы (баднавирусы и нановирусы) интегрируются в виде множественных копий в ДНК хозяина при стрессе (вызывая потерю стрессоустойчивости). Это является существенной помехой программ селекции бабанов.
Трансформация происходит в природе

Трансформация бактерий

Важные требования к трансформации
Возможность ДНК экспессироваться в клетках хозяина (реципиента)
2. Клетки реципиента часто требуют специальной обработки для того, чтобы сделать их «компетентными» к трансформации
3. Система доставки ДНК
4. Системы селекции для распознавания и отбора трансформантов

Что такое экспрессия генов?
Это совокупность реакций, вследствие которых биологическая информация гена становится доступной клетке (работа или активность гена)

эукариоты
Экспрессия генов
прокариоты

РНК-процессинг у эукариот

Конструирование генов для их экспрессии
в других видах
Нужно знать экспрессируется ли ген (часто уже известно).
Если ген из того же или близкого таксона, то ожидается, что он будет экспрессироваться точно также как в организме-источнике (доноре).
Например, ген из двудольных растений практически всегда будет нормально экспрессироваться в другом двудольном растении
Гены разных энтерических бактерий будут работать в таких же бактериях без дополнительных модификаций
Гены человека «работают» в мышах
Если кодирующая последовательность из другого царства, то очень вероятно, что она не будет фукнционировать. Такая последовательность потребует дополнительной добавки – последовательности совместимости, или промотера.
Таким образом. часто требуется создание нового гена – химерной последовательности или ХИМЕРЫ, которую можно создать in vitro (предыдущая лекция)
Все гены (химерные или немодифицированные) пропагируются (наращивается число их копий) при помощи трансформации на плазмидных векторах в бактериях или грибах.

Организм, орган или часть организма, содержащая две или более генетические составляющие. Получается в результате трансплантации органов, пересадок или генетической инженерии.
Вещество, такое как антитела, созданное из белков различных видов.
From Latin chimaera, from Greek khimaira, chimera, she-goat – она-коза – комбинаций двух зверей (чаще козы и льва)
Химера. Что это значит?

Пример генной кассеты (плазмидной конструкции высокой интенсивности) для трансформации растений
Плазмидный вектор
(pUC12)
CaMV 35S
promoter
CaMV polyadenylation sequence

Дрожжевая экспрессионная кассета GAL1
Включает сильный индуцибельный промотер GAL1 (галактоза индуцирует экспрессию, в глюкоза ингибирует)
Доступна коммерчески (фирма - Invitrogen)
Содержит рекомбинационную систему Gateway
Дает высокий уровень экспрессии белка и возможность легкой очистки
Полиаденилатный сайт из CYC1-гена
Способна экспрессироваться в E.coli

Cистемы трансформации

Гены селективных маркеров
Бактерии:
Дрожжи:
Комплементация ауксотрофности
Например URA3 позволяет урацил-ауксотрофному мутанту расти на несодержащих урацил средах.
Ауксотрофы - микроорганизмы, в противоположность прототрофам утратившие способность к самостоятельному синтезу какого–либо метаболита (аминокислоты, витамины и т. д.) в результате мутации и потери способности к образованию соответствующих ферментов.
Трансформация происходит у малого числа клеток.
Требуется создать преимущество для роста именно трансформированных клеток.
Гены резистентности к
антибиотикам
Ген бета-лактамазы (уст-ть к ампицилину и тетрациклину)

Клетки животных:
Устойчивость к антибиотикам
Ген nptII на основе гена E.coli (резистентность к канамицину путем его фосфорилирования)
DHFR: Ген редуктазы дигидрофолата
Клетки растений
Резистентность к антибиотикам и гербицидам
Резистентность к канамицину (nptII)
Резистентность к гигромицину (гигромицин – тот же «аминоглюкозидный» класс антибиотиков, что и канамицин, что имеет свой ген устойчивости) - aphIV
Биалафос/фосфинотрицин/глуфосинат-аммониум – это гербицид, известный под торговыми марками Challenge, Basta, Herbiace. Устойчивость переносится геном из гриба Streptomyces viridochromogenes (Bar = резистентность к биалофосу, bialaphos resistance, pat = фосфинотрицин-ацетил-трансфераза – фермент инактивирующий гербицид посредством ацетилирования).
http://www.bdt.fat.org.br/binas/Library/cabi/harding.html
Гены селективных маркеров

Гены селективных маркеров в случае высших эукариот – это всегда химерные гены
Данный сайт дает некоторые идеи о ресурсах для трансформации
http://www.pgreen.ac.uk/a_pls_fr.htm

Трансформация бактерий
Некоторые бактерии могут быть трансформированы простым добавлением ДНК в культуру.
Непатогенный штамм Pneumococcus IIR может быть трансформирован в большие патогенные колонии посредством трансформации с ДНК IIIS-штамма с вероятностью 1 к 104 клеток
IIR
IIIS

Метод 1: Химическая трансформация бактерий.
Трансформация E.coli
Вырастить культуру до экспоненциальной фазы, охладить и отцентрифугировать (осадить)
Клетки ресуспендировать в холодном растворе 50–100 мM CaCl2 (при их концентрации 1010 мл-1), содержащем плазмидную ДНК
Инкубировать на льду 30 мин
Произвести тепловую обработку - 42ºC на 1 мин
Добавить среду и растить клетки в течение 30-60 мин, чтобы они восстановились
Высеять аликвоты на чашки с селективной средой, содержащей антибиотик
Вероятность (частота) трансформации – 104-105 μг-1 ДНК (1000-10000 клеток на микрограмм добавленной ДНК)
Сейчас коммерческие компетентные клетки имеют частоту трансформации до 107-108 μг-1 ДНК (например, штамм TOP10)
Соль позволяет ДНК и клетки приклеиться друг к другу. Тепловой шок вызывает вход ДНК в клетки.

Метод 2: Электропорация
Типичный протокол для Agrobacterium или Rhizobium
Культуры выращиваются до экспоненциальной фазы, охлаждаются и осаждаются центрифугированием
Клетки ресуспендируются при 1010 мл-1 в холодной стерильной дистиллированной воде
Вышеуказанный шаг повторяется дважды, чтобы отмыть клетки от солей
Клетки смешиваются с ДНК (при температуре льда) и переносятся в предварительно охлажденную электропорационную кювету
Напряжение 4000–8000 Вольт см-1 на несколько миллисекунд подается на кювету.
Клетки вводятся в среду для восстановления на некоторое время и переносятся на чашки (как в методе 1)
Высокая частота трансформации - 109 μг-1 ДНК.
Годится для любых клеток
Работает по принципу образования короткоживущих пор в плазматической мембране клеток, через которые проходит ДНК

электропоратор
Электропорационная кювета

Эукариотическая генетика и молекулярная биология
могут эффективно продуцировать эукариотические гены
S. cerevisiae – стандартное орудие для молекулярно-биологических методик
Высокая стабильность трансформантов
Дрожжевые шаттл-вектора могут поддерживаться как искусственные хоромосомы и как плазмиды в E.coli
Можно получить вставочные мутанты
Известна рамка считывания
Дрожжи могут делать сплайсинг генов животных и растений
Дрожжевая РНК-полимераза распознает многие промотеры животных и растений
Трансформация дрожжей

Трансформирующая ДНК должна быть линеаризована при помощи ферментов рестрикции (рестриктаз). Помним, что бактериальная ДНК должна быть кольцевой – плазмидой.
Наиболее эффективный метод – ацетат лития (LiAc)/полиэтиленгликоль/одноцепочая открытая ДНК (ss-ДНК). Технические аспекты:
Клетки выращиваются до экспоненциальной фазы, промываются водой и ресуспендируются в воде. Далее могут храниться охлажденными или замороженными.
Полиэтиленгликоль (PEG - ПЭГ) – ПЭГ-3000 (цифра означает длину молекул) и Li+ приводят к тому, что ДНК прилепает к клеткам
Одноцепочная незамкнутая ДНК (ss - single stranded fragmented DNA), изготавлиявается посредством нескольких актов кипячения и заморозки из обычной ДНК
Обработка температурным шоком - 42ºC на 40 мин
Далее высев на селективную среду, где колонии образуются в течение 3-4 дней.
http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html
Трансформация дрожжей

Трансформация дрожжей
Все первоначальные (старые) методики, которые обязательно включали ферментативную обработку и получение сферопластов (протопласты грибов) уже не используются.
ДНК интродуцируется посредством кальциевого метода, как для бактерий.
Иначе ДНК может упаковываться в липосомы (липидные везикулы, которые могут сливаться с плазматической мембраной)
Часто используется электропорация.

Трансформация растений
Требования:
- способность генерировать целое нормально размножающееся растение (тотипотентность) из одиночной клетки
- требует знание и освоение методов культур клеток и тканей растений (выбор правильного гормонального режима)
- конструкции ДНК обычно содержат:
*интересующий нас ген(ы)
*ген(ы) селективного маркера
- подбор методов трансформации
- селекционная среда (антибиотик или гербицид)
Два наиболее часто используемых метода трансформации растений: основанный на использовании Agrobacterium и прямая доставка генов - Direct gene transfer (DGT): биолистический

Регенерация целого растения обычно достигается на питательной среде, содержащей определенную комбинацию фитогормонов – в частности, ауксинов и цитокининов.
Два типа регенерации:
Органогенез. Формируется стебель-побег, потом корень (например, табак)
Эмбриогенез. Образуется эмбрион. Который затем развивается в растение (злаки)
Трансформация растений
Разные виды растений и разные их части могут использоваться для трансформации (эмпирический подход в подборе – т.е. берется «то», что лучше трансформируется).
Типичные экспланты для трансформации:
Листовые диски (например, табака)
Диски из столонов (картофель)
Scutellar tissue – скутелла (злаки) C
Семядоли (томаты)
Стебли проростков (салат, капуста, крестоцв.)

Листовые диски табака, в которых регенерируются побеги
Регенрация томатов из листовых дисков и семядолей

3 месяца
Укоренение
Табак

Rice transformation

Трансформация на основе Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens – природный генный инженер
«Происходящий» из почвы патоген растений: образуется галлы - опухоли
Может переносить свою собственную ДНК (Ti-плазмиду) в хромосомы растения
Растение в результате продуцирует специфические питательные элементы для бактерии
Т-ДНК: ‘левая’ и ‘правая’ границы (граничные сигналы); между ними – онкогенные и опинные гены (первые – чтобы росла опухоль, вторые для выработки питат. прод.)
Патоген (от греч. παθογένεια — греч. πάθος — «страдание» и греч. γἰγνομαι — «порождающий»)

Растительные опухоли – гиперплазии, индуцируемые Agrobacterium

Кодирует все гены, необх. для переноса Т-ДНК из бактериума в ядро растения
Типичная Ti-плазмида и её T-ДНК
современные бинарные векторы имеют только правые и левые гнаничные сигналы (границы) Т-ДНК, а гены вирулентности могут содержаться в отдельной плазмиде

Ti plasmid ‘disarmed’: oncogenic and opine genes removed
Gene of interest (plus antibiotic resistance gene) inserted between T-DNA borders
Plasmid transferred into Agrobacterium
Agrobacterium transforms plant cells
Transformed cells selected (antibiotic)
Transgenic plants regenerated
Advantages
low copy number
genes integrated into active regions in chromosomes
Disadvantage: limited by host range
Ti plasmids (continued)

Transformation of plant cells by Agrobacterium

Селекция, регенерация
Биолистика