Электронный Парамагнитный Резонанси его применение в медико-биологических исследованиях

Часть 1. Основы метода ЭПР
Электронный Парамагнитный
Резонанс

Электронный парамагнитный резонанс
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, EPR, ESR) - один из основных прямых методов обнаружения и идентификации (изучения строения) свободных радикалов и комплексов металлов переменной валентности, имеющих неспаренный электрон на молекулярной орбитали.
В основе метода лежит резонансное поглощение электромагнитного излучения неспаренными электронами, помещенными в магнитное поле.
Электрон в атоме участвует в двух видах движения:
1. Орбитальном (l) - вокруг ядра атома и
2. Спиновом (s) - вокруг собственной оси.
Каждый вид движения можно охарактеризовать двумя моментами:
1. Механическим (P), отражающим движение материальной частицы и
2. Магнитным (μ), отражающим движение заряженной частицы.
Атом водорода

Взаимосвязь механического и магнитного моментов
Из классической механики известно, что
момент количества движения электрона на круговой орбите радиуса R
P=mvR,
где m - масса электрона, а v - его скорость.
Движение заряженной частицы по такому же контуру, создает магнитный момент, подобный тому, что возникает при движении тока
μ=IS,
где I - сила тока в контуре (I=ve/2πR), а S - площадь контура (S=πR2) или
μ=veR/2
или, учитывая (P=mvR)
μ=-eP/2m (или μ/P=-e/2m)
Из квантовой механики известно, что
P=nh/2π,
где n - главное квантовое число. Тогда при n=1 получим
μ=-eh/4πm=β (магнетон Бора)

Суммарный магнитный момент
Таким образом, для орбитального движения
μl/Pl=-e/2m
Для спинового движения
μs/Ps=-e/m
Суммарный магнитный момент равен:
μj=μl+μs,
А суммарный механический равен:
Pj=Pl+Ps
Однако
μj/Pj≠μl/Pl ≠ μs/Ps
поэтому вводят коэффициент пропорциональности (g)
μj/Pj=-g*e/2m,
где g это g-фактор, т.е. коэффициент, показывающий вклад орбитального и спинового момента в суммарный момент.
В конечном итоге, поскольку μl<<μs, то μj≈μs и
μj≈-g*e/2m*h/2π*S =-gβS

Энергия электрона в магнитном поле
равна
E=μ*H*cos(μ,H),
где μ - суммарный магнитный момент электрона,
H - напряженность магнитного поля,
cos(μ,H) - угол между векторами μ и H (обычно = 1 или -1),
тогда подставив значение μ получим
E=-gβSH,
Где S - спиновое квантовое число = +1/2 или -1/2. В итоге
E=±1/2gβH

Ориентация электронных спинов в магнитном поле
В отсутствие внешнего магнитного поля все механические и магнитные спиновые моменты электрона ориентированы случайным образом
В присутствии внешнего магнитного поля они могут быть ориентированы только двумя способами:
по полю или против поля.
В отсутствие
магнитного поля
При включенном
магнитном поле

H
E
При наложении магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются по полю или против поля. Их энергии изменяются, а энергетический уровень расщепляется на два.
H
.
E0
В отсутствие внешнего магнитного поля электроны ориентированы случайным образом и имеют практически одинаковую энергию (E0)
Расщепление энергетических уровней в магнитном поле
(эффект Зеемана)
H=0

H
E
-1/2 gβH
Система, где электроны распределены между двумя энергетическими уровнями, может поглощать электромагнитное излучение. При определенных значениях величины энергии падающего кванта (hν) , будут происходить переходы электронов между уровнями.
+1/2 gβH
E = hν
ΔE = gβH
Поглощение будет происходить при условии равенства энергий поглощаемого кванта и энергии перехода между уровнями, т.е. когда
hν = gβH
Это выражение называется – основным уравнением резонанса
Поглощение электромагнитных волн
(явление ЭПР)

Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков?
Разность между числом электронов (заселенностью) на двух разных энергетических уровнях в парамагнетиках определяется уравнением Больцмана:
ns=½ - число электронов c s=½.
ns= -½ - число электронов c s= -½.
ns=½
парамагнетик
диамагнетик
ns= -½
ns=½
ns= -½

Метод был открыт Евгением Константиновичем Завойским в Казанском Университете в 1944 году. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле поглощает радиоволны в микроволновом диапазоне.
Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые в 1958 с помощью метода ЭПР обнаружили свободные радикалы полученные под действием ионизирующего излучения на белки.
История открытия явления ЭПР

Усилитель
Записывающее устройство
Аттенюатор
Микроволновой источник
(клистрон)
Микроволновой резонатор
Детектор
Образец
Двойной Т-мост
ЭПР спектрометр

В Казанском ГУ

Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР

Прибор Завойского для измерения ЭПР

Как получить сигнал ЭПР ?
Поглощение электромагнитных волн в радиоспектрометре ЭПР можно определять двумя способами:
1 - При постоянном магнитном поле, мы можем изменять частоту излучения. Максимальное поглощение будет наблюдаться при резонансе, когда hν = gβH
При этом ожидаемый спектр будет таким:
2 - По техническим причинам мы поступаем по другому: мы используем микроволновое излучение при постоянной частоте волн и изменяем магнитное поле.

Что такое сигнал ЭПР ?
ν = const
H
поглощение
hν = gβH
Кроме того, в результате усиления сигнала ЭПР (путем его модуляции) мы получаем не поглощение A, а - первую производную поглощения по полю dA/dH.
dA/dH
H
hν = gβH

Часть 2. Спектры ЭПР
Электронный Парамагнитный
Резонанс

77 K
300 K
УФ облученный цистеин
Примеры сигналов ЭПР
g=4,3
g=2,25
Нитрозильные
комплексы
g=2,03
g=1,94
Fe-S белки
Цитохром P-450
Метгемоглобин
Радикалы
аскорбата
Печень крысы при 77 K
g=2,00

Основные характеристики сигнала ЭПР
4) сверхтонкая структура

Амплитуда сигнала ЭПР
C = Cs(S / SS)
Площадь S под линией поглощения прямо пропорциональна концентрации пара-магнитных частиц в измеряемом образце (C).
где k - коэффициент зависящий от условий измерения.
C = k*S
dA/dH
H
H
A
Второй интеграл-это площадь (S) под
кривой поглощения
(т.е. это число)
сигнал ЭПР
кривая
поглощения
площадь
под кривой
поглощения
Амплитуда сигнала ЭПР зависит от количества поглощающих частиц и пропорциональна площади под кривой поглощения, т.е. второму интегралу от сигнала ЭПР.
Практически получить значения S нетрудно. Существенно труднее найти величину k. Поэтому на практике при вычислении С обычно пользуются сравнением площади измеряемого образца S (концентрацию которого надо найти) с площадью эталонного образца Se (концентрация Ce которого известна).
А

Ширина сигнала ЭПР
где Δ t - время измерения и ΔE - неопределенность энергии системы.
Ширина сигнала ЭПР определяется взаимодействием магнитных моментов электрона с окружением. Теоретически минимальная ширина линии следует из соотношения неопределенностей Гейзенберга:
Рассматриваемый процесс - это поглощение электромагнитного кванта, такое, что Δ t может быть интерпретировано как время нахождения электрона на верхнем энергетическом уровне (время релаксации T ), а Δ E как энергия системы нашем случае = gβH, отсюда
dA/dH

Спин-решеточная релаксация (T1) обусловлена взаимодействием магнитного момента электрона с решеткой (т.е. средой в которой находятся парамагнитные частицы).
Время релаксации
Процесс релаксации характеризуется временем релаксации. Время релаксации (т.е. время нахождения электрона в состоянии с большей энергией) зависит от двух процессов: спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.
время релаксации
Релаксация - процесс восстановления заселенности энергетических уровней после поглощения кванта электромагнитного излучения.
Спин-спиновая релаксация (Т2) Обусловлена взаимодействием– с другими парамагнитными частицами (т.е. спинами)

Большое T
Малое ΔH
Малое T
Большое ΔH
Комплексы металлов - T1=1 нс ΔH=10 мТ
Свободные радикалы - T1=0,1 мс ΔH=100 мкТ
Зависимость суммарного времени релаксации (Т) от Т1 и Т2 выражается формулой:
Тогда выражение для ширины сигнала ЭПР будет выглядеть так:

2. Взаимодействие спинового магнитного момента электрона с орбитальным магнитным моментом электрона приводит к уширению сигнала в результате анизотропии g-фактора
3. Взаимное превращение форм радикала вызывает динамическое уширение сигнала
R1
R2
4. Соударение радикала с другим радикалом или парамагнитным ионом лежит в основе уширения за счет спинового обмена
Механизмы уширения сигнала ЭПР :
1. Взаимодействие магнитных моментов двух парамагнитных частиц (радикалов или ионов) приводит к уширению по диполь-дипольному механизму

g-фактор
g-фактор сигнала ЭПР - это не только параметр, отражающий вклад орбитального и спинового моментов в суммарный магнитный момент, но и характеристика, показывающая положение сигнала ЭПР во всем диапазоне магнитного поля.
g=4,3
g=2,25
g=1,94
Fe-S белки
Цитохром P-450
Метгемоглобин
Радикалы
аскорбата
g=2,00
увеличение H
увеличение g
Из основного уравнения резонанса следует, что
при ν=const
Следовательно, при увеличении H происходит снижение g, и наоборот. Однако, величину Н нельзя считать характеристикой сигнала ЭПР, т.к. при изменении ν резонанс будет происходить уже при других значениях Н. Величина g не изменяется при изменении Н (т.е. она инвариантна от метода измерения), и поэтому g-фактор - характеристика сигнала ЭПР.

Сверхтонкое взаимодействие
Взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с магнитным моментом ядра соседнего атома (например, H или N) называется сверхтонким взаимодействием и приводит к появлению сверхтонкой структуры сигнала ЭПР
H
H3C
OH
электрон
протон
Протон имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в двух направлениях (вдоль и поперек поля) т.к. подобно электрону, имеет спиновое число S = ±1/2.
протоны
Магнитный момент протона создает магнитное поле (+Hp или –Hp, зависящее от ориентации протона), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0).
Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин протона=1/2) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии протона (H0) (если спин протона=-1/2).
В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из двух линий
Расстояние между линиями будет зависеть от величины магнитного поля создаваемого протоном в месте нахождения неспаренного электрона, которое в свою очередь зависит от расстояния между электроном и протоном

Сверхтонкая структура
Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к двум протонам, как в радикале этанола (.CH2-CH2-OH)
H
HC
OH
H
H
электрон
протон
Магнитное поле вокруг неспаренного электрона теперь может иметь следующие значения:
H0 + Hp1 + Hp2 = H0 + 2Hp
H0 + Hp1 - Hp2 = H0
H0 – Hp1 + Hp2 = H0
H0 – Hp1 - Hp2 = H0 - 2Hp
Как результат, сигнал ЭПР радикала расщепляется на 3 линии
2Hp
2Hp
Состояние Н=Н0 реализуется двумя способами (а Н=Н0+2Нр или Н=Н0-2Нр только одним), следова-тельно вероятность этого состо-яния (и интенсивность сигнала) будут вдвое больше.
Расстояние между линиями (в данном случае 2Нр) является основной характеристикой взаимодействия неспаренного электрона с магнитным ядром. Эта величина называется, также, константой сверхтонкого взаимодействия.
В конечном итоге вместо одного сигнала будет три с соотношением интенсивностей 1:2:1

Сверхтонкое взаимодействие (продолжение)
N=O
H3C
СH
электрон
протон
Атом азота имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в трех направлениях (вдоль поля, против поля и «поперек» поля) имеет спиновое число S = ±1 и 0.
Магнитный момент азота создает магнитное поле (+Hp или –Hp, и Н=0), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0).
H0+0
H0 - Hp
H0 + Hp
азот
электрон
Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин азота=1) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии азота (H0) (если спин азота=-1), либо не изменяется, если спин =0.
В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из трех линий

Часть 3. Практическое применение в медико-биологических исследованиях
Электронный Парамагнитный
Резонанс

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
естественные сигналы ЭПР
метод спиновых меток и зондов
метод спиновых ловушек

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
естественные сигналы ЭПР
метод спиновых меток и зондов
метод спиновых ловушек

Если взглянуть на спектр ЭПР, например, печени крысы, то можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, сигнал метгемоглобина и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов. Благодаря коротким временам релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота (77 К).
100 Гс
g=4,3
g=2,25
g=2,03
g=2,00
g=1,94
Fe-S белки
цитохром Р-450
свободные радикалы
Спектр ЭПР печени крысы

Радикал аскорбата
аскорбат
радикал
аскорбата
дегидроаскорбат
Сигнал ЭПР радикала аскорбата можно наблюдать непосредственно в крови или плазме.
Добавление пероксидазы приводит к увеличению сигнала ЭПР и последуюему его исчезновению. Длитель-ность кинетики пропорци-ональна концентрации аскорбата в крови.
+ пероксидаза

Спектр ЭПР облученного УФ светом цистеина
Повысить концентрацию свободных радикалов, для избежания трудностей при их изучении, можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения (УФ или ионизирующей радиацией) биологических объектов находящихся при низкой температуре.
Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах
hν

Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов
семихинонный радикал убихинона Q10
феноксильный радикал α-токоферола
семихинонный радикал α-токоферола

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
естественные сигналы ЭПР
метод спиновых меток и зондов
метод спиновых ловушек

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин, равный ±1 или 0.
Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала
2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО).
Метод спиновых зондов

Время корреляции τc
Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым. Это движение можно охарактеризовать временем корреляции (τс):
При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент.
10 Gs
Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных τс
где ΔH +1 - ширина низкопольной компаненты
I+1 - амплитуда низкопольной компаненты
I-1 - амплитуда высокопольной компаненты

Используя уравнение Стокса-Эйнштейна можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе
где R - эффективный радиус нитроксильного радикала.
T – абсолютная температура
τ - время корреляции
η - вязкость
Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран.
Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с микровязкостью среды

Представленные спектры ЭПР отражают поведение зонда ТЕМПО в средах с различной гидрофобностью. Определив отношения a / (a + b) или (a / c) в этом спектре, можно посчитать параметр гидрофобности f, показывающий сколько и в какой фракции мембраны содержится зонда. Параметр f удобен при изучении процессов перекисного окисления в мембранах.
a
b
c
Параметр гидрофобности f

Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита
При анизотропном вращении стеариновой кислоты вокруг длинной оси сигнал ЭПР будет сильно зависеть от степени анизотропии вращения, который количественно характкризуется так называемым параметром упорядоченности S
Определить параметр упорядоченности S, можно измерив константы сверхтонкого расщепления – А|| и А┴ и подставив их значения в формулу

Параметр упорядоченности S равен 1, есливращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны.
В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1.
В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР.
Параметр упорядоченности и вязкость мембраны

Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения конуса вращения γ

Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты
С-5
С-9
С-12
С-16

Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН
Казалось бы, что измерение рН достаточно легко и точно можно проводить с помощью рН-электродов, однако очень трудно если не невозможно измерить рН внутри лизосомы или фагоцитирующего лейкоцита. Для этих целей и применяют рН-чувствительные спиновые зонды. В основе метода рН-чувствительных зондов лежит способность зонда давать отличные друг от друга спектры ЭПР в протонированной и депротонированной формах.
Таким образом, существует узкий диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР зонда.

aN=(aNR + aNRH+)/2
Зависимость параметра f и aN от рН
f =(IR)/(IR + IRH+)
aNR и aNRH+ константы СТВ радикалов R и RH+
IR и IRH+ амплитуды сигналов ЭПРрадикалов R и RH+

Спектр ЭПР нативного химотрипсина, помеченного спиновой меткой.
I1
I0
Денатурация белка приводит к увеличению подвижности полипептидных цепей и соответственно увеличению подвижности спиновой метки.
Соотношение величин I0 и I1 используется для количественной характеристики подвижности спиновой метки.
Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой

В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной молекулой или макромолекулой.
3. Глубинный участок
Белок
1. Водная фаза
2. Поверхностный слой
Спектры ЭПР спиновой метки при взаимодействии с SH-группами белка

Аллостерические эффекты в гемоглобине, меченым иминоксольным радикалом в геминовой группе при 25C.
a - спектры ЭПР,
b - путь включения метки в α-цепи гемоглобина и присоединение О2 к геминовой группе в β-цепях.
R - spin labels.
Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях:
естественные сигналы ЭПР
метод спиновых меток и зондов
метод спиновых ловушек

Основы метода спиновых ловушек
(spin trapping assay)
Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях не превышает 10 нМ.
Минимальная концентрация свободных радикалов, которую можно обнаружить методом ЭПР 100 нМ
R• + ST → SA•
Предложен в 1965-67 независимо Konaka T. (Япония), R. Lagercranz (Швеция) и E. Janzen (Канада).

Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов
α-фенил-N-трет-бутил нитрон (PBN)
PBN спиновый аддукт
aN
aβH
ΔHpp

Основные виды спиновых ловушек
нитрозосоединения
нитроны
Нитронил-нитроксилы
PBN
DMPO
нитрозобензол
трет-нитрозобутан
DEPMPO
NNR

Основные требования к спиновым ловушкам
Быстрые реакции с радикалами
Отсутствие побочных реакций
Образование стабильных аддуктов
Отличие в параметрах спектра ЭПР спиновых аддуктов у разных радикалов

Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов

Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов
Если известны: (1) тип СЛ, (2) Р-ритель, (3) aN (мТ) и (4) aβH (мТ) СА можно легко идентифицировать в базе данных http://epr.niehs.nih.gov спектров ЭПР.