ПРОБЛЕМЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С д.мед.н., проф. А.Л. Гураль д.мед.н. Т.А. Сергеева д.мед.н. В.Р. Шагинян

Вирусом гепатита С инфицированы от 500 млн. до 1 млрд. людей. Фактически, в настоящее время в мире наблюдается пандемия гепатита С, которая по своим масштабам в 5 раз превышает распространение ВИЧ-инфекции
У 70-85% инфицированных HCV развивается хронический гепатит – основная клиническая форма этой болезни. Диагноз гепатита С чаще устанавливают на этапе сформировавшегося хронического гепатита или цирроза печени.
В последние годы в странах ЕС были предприняты инициативы, направленные на повышение «настороженности» в плане вирусных гепатитов. В 2006 г. в Европейском парламенте было определено, что процесс гармонизации систем надзора за вирусными гепатитами в ЕС – одно из приоритетных направлений деятельности European Centre for Disease Prevention and Control – ECDC.
М.С.Балаян, М.И.Михайлов, 2000; J.H. Kao, D.S. Chen, 2002;
D. Lavanchy, 2004; J. Alexander, K.V. Kowdley, 2006-2008;
A. Craxi, 2003; A.-M. Giroud-Robert 2004; G.L. Atmstrong et al., 2006-2008;
ECDC, 2008; Р. Marcellin, 2009
ИЭИБ

ИЭИБ
Основные проблемы специфической диагностики
гепатита С
Отсутствие нормативной базы в отношении проведения обследований на специфические маркеры HCV-инфекции различных групп населения;
Отсутствие в широкой лабораторной практике (и в первую очередь в службе крови) молекулярно-биологических методов исследования; коммерциализация этой сферы лабораторных услуг;
Отсутствие регламентированной унифицированной стратегии специфической диагностики HCV-инфекции и соответствующего алгоритма проведения первичных (скрининговых) и подтверждающих исследований на наличие серологических и генетических маркеров инфицирования в зависимости от целей и задач исследования;
Недостаточный охват тестированием различных групп населения.

ИЭИБ
Нормативная база в отношении проведения специфических обследований на маркеры инфицирования HCV ограничивается Приказом МЗ Украины 106 «Про обстеження донорів на гепатит С» (1994), № 385 «Про інфекційну безпеку донорської крові та її компонентів» (2005) и Приказом Минобороны Украины № 402 (2008)

ИЭИБ
Результаты обследований на серологические маркеры гепатита С некоторых групп населения в 2008-2009 гг. (ЦСЭС)
В 2008 г. официально зарегистрировано 873 случая острого ГС,
В 2009 г. – 964, в 2010 г. – 786 случаев

ИЭИБ
Распространение гепатита С в различных
группах населения
А.Л. Гураль, В.Ф. Мариевский, 2006-2010; Т.А. Сергеева, 2008; О.Н. Рубан, 2010

The disease iceberg for Hepatitis C
(J. Parkes, P. Roderick, B. Bennett-Lloyd, and W. Rosenberg, BMC Public Health. 2006)
Anti-viral treatment
Eligible for treatment
Attend specialist service
Referred to specialist service
Positive HCV test
Untested & unknown to services
ИЭИБ

ИЭИБ
Специфические лабораторные обследования
Диагностические исследования направлены на установление и/или верификацию диагноза; их необходимо осуществлять при подозрении (или с целью исключения) острого или хронического инфекционного процесса гепатита В и гепатита С.
Обследования по эпидемическим показаниям направлены на расследование вспышек, оценку эффективности противоэпидемических и профилактических мероприятий, проводятся с целью сероэпидемиологических исследований. Эпидемическими показаниями также являются: возникновение единичных или групповых заболеваний в ЛПУ, детских дошкольных, специализированных заведениях, других организованных коллективах, в семейных очагах инфекции, в окружении больных острыми или хроническими вирусными гепатитами, вирусоносителей; при возможном профессиональном инфицировании и в ряде других случаев.
Профилактические обследования должны распространяться на определенные группы лиц, к числу которых относятся: доноры крови, костного мозга, органов и тканей; беременные; медицинские работники и целый ряд других контингентов.
Целевые обследования, направленные на обеспечение потребностей дозорного эпидемиологического надзора, который основывается на систематическом сборе и анализе данных об особенностях развития эпидемического процесса в выборочных группах населения (дозорных, целевых, фокусных) с целью раннего выявления случаев заболевания в группах риска или же для получения индикаторных показателей в отношении тенденций развития эпидемического процесса в конкретных популяциях.

ИЭИБ

ИЭИБ
Специфическая диагностика гепатита С
- выявление диагностических маркеров инфицирования: антигенов, антител, генетического материала вируса с помощью современных серологических и молекулярно-биологических методов исследования.
Методы выявления
маркеров инфицирования HCV
Прямые
Непрямые
Молекулярно-биологические
Серологические
РНК HCV
Антитела, антигены HCV

ИЭИБ
Серологические методы исследования
- применяются как при первичном скрининге, так и в диагностике HCV-инфекции.
Первичные скрининговые тесты (главным образом, ИФА);
Дополнительные аналитические тесты (ИБ);
Исследования, направленные на серологическое определение генотипа вируса («серотипирование»).
При остром гепатите С специфические антитела могут быть определены у 50-70 % пациентов в начале симптоматической фазы.
В среднем, сероконверсия определяется в сроки от 8 до 12 недель от момента инфицирования, (это время может варьировать от 5 до 50 недель).
Промежуток времени, предшествующий сероконверсии – период «окна» (серонегативное, латентное, инфекционное, диагностическое окно).

ИЭИБ
Возможные причины ложно-положительных и
ложно-отрицательных результатов выявления анти-HCV:
Ложно-положительные:
Неспецифическое связывание иммуноглобулинов сыворотки крови с компонентами иммуносорбента тест-системы;
Повышенный уровень гамма-глобулина в сыворотке (у больных с ревматизмом, некоторыми злокачественными заболеваниями и т. п.);
Аутоиммунные заболевания, заболевания соединительной ткани;
Некоторые инфекционные болезни (гепатит В, туберкулез и др.);
Следствие иммунизации; беременность и др.
Проведение исследования в популяции с низкой распространенностью HCV-инфекции.
Ложно-отрицательные:
У лиц с иммуносупрессией (у ВИЧ-инфицированных, реципиентов трансплантатов солидных органов, при гипо- и агаммаглобулинемии, у пациентов, находящихся на гемодиализе.
Частота ложно-положительных результатов при выявлении
анти-HCV среди различных групп обследованных лиц

ИЭИБ
Конфирматорные подходы, подтверждающие присутствие анти-HCV
Повторное тестирование реактивных образцов в той же самой тест-системе ИФА
Перестановка позитивного образца в другом, альтернативном тесте ИФА
Исследование методом ИБ
Определение антител к отдельным белкам вируса в формате ИФА
NAT тесты для выявления РНК ВГС (но они не могут рассматриваться как истинно конфирматорные тесты)
В идеале, все первично реактивные образцы необходимо повторно исследовать при помощи более специфичных тестов.
Верификация присутствия анти-HCV минимизирует ненужные посещения медицинских учреждений и психологическую травму для людей с ложно-положительными результатами тестирования

С
Е1
E2/NS1
NS2
NS3
NS4
NS5
C22
gp36
gp70
C200
C33
C100
NS5
5-1-1
СХЕМА ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА ГЕПАТИТА С
ИЭИБ

Благоприятные и неблагоприятные признаки выявления антител к структурным и неструктурным белкам HCV
ИЭИБ

ИЭИБ
Варианты интерпретации результатов выявления антител к ВГС
Корреляция между присутствием анти-HCV core IgМ и обнаружением РНК вируса в сыворотке крови и составляет от 77 % до 92 %.
Анти-HCV core IgМ обнаруживаются в сыворотке крови
50-93 % пациентов с острым и 50-70 % больных хроническим гепатитом С.
Присутствие анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5 коррелирует с наличием вирусной РНК.
Антитела к антигенам NS4 могут свидетельствовать о перенесенной инфекции; косвенно подтверждать активность репликации ВГС при хроническом гепатите С; свидетельствовать о начале хронизации процесса у больных острым ГС.

ИЭИБ
Молекулярно-биологические методы диагностики
Качественные методы выявления РНК
Количественные
методы выявления РНК
Методы
генотипирования
и выявления мутаций
HCV РНК может быть определена через 2 недели от момента инфицирования HCV
Ранняя и эффективная диагностика
Подтверждение результатов скрининга
Прогноз течения и исходов заболевания
Определение показаний к терапии
Выбор оптимальной тактики лечения
Предсказание эффективности специфической терапии
Мониторинг эффективности терапии
Оценка устойчивости ответа на терапию

ИЭИБ
Возможные причины ложных результатов выявления РНК HCV
Утрата или разрушение нуклеиновых кислот вируса во время подготовки образцов;
Наличие в исследуемом материале различных химических или белковых субстанций, которые могут служить ингибиторами для отдельных компонентов ПЦР;
Концентрация НК у обследуемого лица может быть ниже предела чувствительности используемого метода и т.д.;
Контаминация: между пробами, положительным контрольным образцом, ампликонами;
Оккультная HCV-инфекция.
Оккультная HCV-инфекция – присутствие РНК HCV на уровнях, которые повторно не обнаруживаются в сыворотке или плазме крови при текущих клинико-лабораторных исследованиях, но обнаруживаются в мононуклеарах периферической крови и / или тканях печени с помощью молекулярных методов исследования более высокой чувствительности. В большинстве случаев состояние оккультного гепатита С сопровождается наличием анти-HCV (вместе с тем, отсутствие этих антител не исключает оккультную инфекцию).
Pham TNQ, MacParland SA, Mulrooney PM et al., 2004;
Radkowski M, Gallegos-Orozco JF, Jablonska J et al., 2005;
Castillo I, Rodriguez-Inigo E, Lopez-Alcorocho JM, Pardo M, 2006;
Pham TNQ, Mulrooney-Cousins PM, Mercer SE et al., 2007; Blackard JT, Kemmer N, Sherman KE, 2006

ИЭИБ
Интерпретация результатов исследования

ИЭИБ
Диагностическая значимость специфических маркеров
инфицирования ВГС
(М.И.Михайлов, 2001)

ИЭИБ
1. Предварительная оценка степень риска инфицирования пациента.
2. Первоначально показано исследование на наличие анти-HCV.
3. Определение HCV RNA рекомендуется:
а) позитивный результат ИФА на анти-HCV;
б) планирование противовирусная терапии (количественная ПЦР для определения исходного значения вирусной нагрузки);
в) при иммуносупрессии, признаках заболевания печени, подозрении на острый гепатит С и негативных результатах обнаружения анти-HCV
4. Определение генотипа HCV – всем пациентам до начала противовирусной терапии (для выбора дозы препаратов, длительности лечения и оценки ожидаемой эффективности).
Примерный алгоритм тестирования
ИФА на анти-HCV
-
+
Подтверждающее исследование
-
+
Повторное исследование

ИЭИБ
«… Если же сюда добавить и все те хронические состояния здоровья и ограничения трудоспособности, которые являются последствиями перенесенных острых инфекционных болезней, то удельный вес отрицательного значения инфекционной заболеваемости еще более возрастет ...»
Громашевский Л.В. От обороны к нападению // На фронте здравоохранения. – 1931. – № 22. – С. 43-49