Сучасні методи визначення

Бензодиазепіни – клас психоактивних речовин зі снодійним, седативним, анксиолітичним (зменшення відчуття тривоги), міорелаксуючим та протисудомним ефектом. Входять в групу речовин депресантів ЦНС.
Це конденсовані гетероциклічні системи, що мають у своєму складу бензольне та 1,4-диазепінове ядра.
Перший бензодиазепін, хлордиазепоксид, був синтезований в 1955 році, Лео Стернбахом під час розробки транквілізаторів.

Екскурс в історію
Перший бензодиазепін, хлордиазепоксид, був синтезований в 1955 році, Лео Стернбахом під час роботи в Hoffmann-La Roche при розробці транквілізаторів. Фармакологічні властивості первих отриманих сполук не задовольняли всі вимоги і експеримент був припинений. Два роки потому, в квітні 1957 р. співробітник Ерл Рідер під час генерального прибирання в лабораторії помітив «гарну кристалічну речовину», що зосталася після закритого проекта. Були проведені досліди на тваринах і в даній речовині були виявлені дуже сильні седативні та міорелаксуючі ефекти. Ці дані призвели до його швидкого впровадження в клінічну практику у всьому світі в 1960 році під торговою маркою «Лібіріум». В 1959 році був синтезований діазепам, який почав продаватися компанією Hoffmann-La Roche під торговою маркою «Валіум».
Нова група препаратів спочатку була прийнята медиками з оптимізмом, але поступово почали виникати проблеми, і в 1980 році був виявлений ризик залежності. Бензодиазепіни мають унікальну історію в тому, що через них був поданий найбільший груповий позов проти виробників лікарських препаратів у Великобританії з участю 14,000 пацієнтів та 1,800 юридичних фірм, які стверджували, що виробники знали, але приховували про здатність ліків викликати залежність. Вина виробника доведеною не була.

Фармакокінетика 1,4-бензодиазепінів
Всі бензодиазепіни добре всмоктуються з травного тракту, досягаючи максимального рівня в крові вже через 1 – 3 години, але спостерігаються деякі відмінності в їхній поведінці в організмі.
Бензодиазепіни активно зв’язуються з білками крові, проявляють високу спорідненість до жирових тканин, в яких накопичуються і вже з них виділяються в кров. Цим явищем в значній мірі забезпечується досить довгий період їхнього напіввиведення.
Бензодиазепіни виділяються найперше всього з сечею (вище 60% дози), інша частина виділяється через травний тракт.
Похідні бензодиазепінів піддаються біотрансформації в печінці, перетворюючись в декілька метаболітів, що проявляють, в свою чергу, більшу фармакологічну активність. Процеси трансформації включають в себе реакції окиснення, деметилювання, дезамінування, гідроксилювання, ацетилування, відновлення, конг’югації з глюкороновою кислотою.

Табл. 1.Фармакокінетика 1,4-бензодиазепінів

Табл. 2.Максимуми поглинання 1,4-бензодиазепінів

Метаболізм діазепаму (“Валіум”, “Седуксен”, Фаустан”)
1 – діазепам
2 – дезметилдіазепам
3 – метилоксазепам
4 - оксазепам

Метаболізм нітразепаму (“Неозепам”, “Радедорм”…)

Метаболізм феназепаму

Метаболізм медазепаму (“Нобріум”)

Об’єкти дослідження:
Кров;
Плазма;
Сиворотка крові;
Сеча (≥ 10 мл);
Тканини нирок, печінки (≥ 200 г);
Шлунок та тонкий кишківник з вмістом(≥ 200г);
Таблетки.
Об’єкти заморожують.
Проводити консервування не рекомендують!
Аналіз 1,4 –бензодиазепінів бажано проводити негайно.

Пробопідготовка фармацевтичного препарату (таблетки)
таблетки
подрібнюють
Розчиняють в КОН
Перемішують,
прогрівають
Відстоюють 10-15 хв, фільтрують
Пробопідготовка сечі
Зразок сечі
+ стандартний розчин
+ буфер Na2SO4,
С4H9Cl
Центрифугують
Відокремлюють шар С4H9Cl
Випарюють
досуха
Розчиняють в КОН

Пробопідготовка сечі
Зразок крові
+ K2HPO4
Струшують
(до розчинення фосфатів)
+ бензол-трихлорметан
Струшують та центрифугують
Верхню орг.фазу в чисту пробірку
випарюють
Сушать у вакуумні печі

Тест-смужка “NARCOSCREEN” для виявлення бензодиазепіна в сечі
Визначення ґрунтується на принципі імунно-хроматографічного аналізу , при якому наркотик (чи його метаболіти), що знаходяться в пробі сечі або слюни, конкурують з реагентами, що іммобілізовані на пористій мембрані даної смужки за обмежену кількість антитіл.
Переваги:
точність: 99,9%;
швидкість;
результат аналізу неможливо змінити;
простий в застосуванні;
доступна вартість: 32 руб.
Виробник: InTec Products. Inc.

Тест-смужка иха-БЕНЗОДИАЗЕПИН-фактор призначена для одноетапного швидкого якісного виявлення бензодиазепіна (та його метаболітів) в сечі людини методом імуннохроматографічного аналізу.
Чутливість: 300 нг/мл
Термін придатності: 18 місяців
Ціна: 33,00 руб. (8,43 UAH)

Рис. 1.Спектри поглинання діазепаму в метанолі(а), 5% метанольному розчині оцтової кислоти (d)
(UV-VIS Lambda-20 Perkin-Elmer computerized spectrophotometer, l = 1,00 см)
Фотометричне та флюорометричне визначення

Рис. 3.Спектр флуоресценції діазепаму в метальному розчині КОН (Shimadzu RF-540 Spectrofluorimeter,
λ = 240,0 нм)
Рис. 2.Спектри поглинання діазепаму в 0,5% метальному розчині КОН(g)
(UV-VIS Lambda-20 Perkin-Elmer computerized spectrophotometer, l = 1,00 см)
Фотометричне та флюорометричне визначення

Фотометричне та флюорометричне визначення
лінійний діапазон:
фотометричне визначення: 0,13 – 1,3 нг/мл
флюорометричне визначення: 5,67 – 16,47 нг/мл
низькі МВ:
фотометричне визначення: 1,27 нг/мл
флюорометричне визначення: 7,13 нг/мл
(для діазепаму, бромазепаму, клоназепаму);
Переваги:
простота;
точність;
відсутність перешкод від ендогенних зразків в зразках сечі (окрім діазепаму).

Потенціометричне визначення
Іон-селективний електрод з твердою мембраною
AgCl + e ↔ Ag + Cl-
Cl- + carrier (membrane) ↔ Cl- carrier (membrane)
drug-Cl + TPB (membrane) ↔ drug-TPB + Cl-
Рис. 3. Схема SC-ISE

Табл. 3. Результати потенціометричного визначення діазепаму

Газо-рідинна Хроматографія
Рис.4. Хроматограма суміші бензодиазепінів до (А) та після (В) стабілізації колонки

МВ: 0,2 – 0,5 нг/мл
лінійний діапазон:: 5 -200 нг/мл
Рис.5. Стандартний графік для визначення нітразепаму в крові.
(серія проведена в різні дні. Внутрішній стандарт: клоназепам , 150 нг/мл)
Газо-рідинна Хроматографія

Таблиця 4
Порівняльна характеристика розглянутих сучасних методів визначення 1,4-бензодіазепаму