ВЫДЕЛЕНИЕ, СЕЛЕКЦИЯ И характеристика

Грамположительные неспорообразующие палочки с высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (55 – 67 моль %)
Факультативные анаэробы
Ключевой фермент метаболизма гексоз – фруктозо-6-фосфат фосфокетолаза
Характерные признаки
Выделение, селекция и характеристика биотехнологически ценных штаммов бифидобактерий

Бифидобактерии – представители симбиотической микрофлоры кишечника человека и животных
Выделение, селекция и характеристика биотехнологически ценных штаммов бифидобактерий

ПРИМЕНЕНИЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ
В БИОТЕХНОЛОГИИ
Лечебно-профилактические препараты
Продукты функционального питания
Выделение, селекция и характеристика биотехнологически ценных штаммов бифидобактерий

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:
выделение, селекция и характеристика штаммов бифидобактерий как основы для разработки пробиотиков и продуктов функционального питания
Выделение, селекция и характеристика биотехнологически ценных штаммов бифидобактерий

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Оптимизировать состав питательной среды для выделения бифидобактерий
Выделить, идентифицировать и охарактеризовать штаммы бифидобактерий из фекалий человека и животных, отобрать культуры, пригодные для производства пробиотиков и продуктов питания
Методом адаптивной селекции получить кислотоустойчивые штаммы бифидобактерий, перспективные для использования в составе пробиотиков и продуктов питания, исследовать их физиолого-биохимические свойства
Подобрать условия криоконсервации бифидобактерий, обеспечивающие их высокую выживаемость и сохранение физиолого-биохимических свойств
Проанализировать эффективность применения выделенных и селекционированных штаммов бифидобактерий для получения пробиотиков и продуктов питания на основе коровьего молока, соевого молока, морковного сока
Выделение, селекция и характеристика биотехнологически ценных штаммов бифидобактерий

Оптимизация состава питательной среды для выделения бифидобактерий
Таблица 1 – Рост коллекционных штаммов бифидобактерий,
молочнокислых бактерий, энтеробактерий на разных композициях
базовых питательных сред и селективных компонентов
Примечания – К* – контроль, 10-8** – последнее разведение, при высеве которого формировались изолированные колонии (<10 на чашку), -*** – отсутствие роста

Таблица 2 – Результаты тестирования селективности питательных сред
МРС-ЛПА и МСК-ЛПА с использованием образцов пробиотиков,
кисломолочных продуктов, фекалий человека и животных
Оптимизация состава питательной среды для выделения бифидобактерий

Положение, выносимое на защиту (1):
Питательная среда для выделения бифидобактерий на основе среды для анаэробов с добавлением селективных компонентов – хлорида лития, пропионата натрия и азида натрия, обеспечивает преимущественный рост представителей рода Bifidobacterium и позволяет дифференцировать их от молочнокислых бактерий
Оптимизация состава питательной среды для выделения бифидобактерий

Рисунок 3 – Электрофореграмма продуктов амплификации
геномной ДНК выделенных культур бифидобактерий родоспецифичными праймерами Bif-164-f и Bif-662-r
Рисунок 2 – Морфология клеток бифидобактерий,
выделенных из фекалий человека
Выделение и идентификация бифидобактерий
1 – Н1, 2 – В3, 3 – А4, 4 – А6, 5 – И1,
6 – С6, 7 – К3, 8 – Д1, 9 – 4,
М – маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler 1 kb Plus Ladder
а, в, г – Н1, б, д – Н2, световая микроскопия 1×2 000 (а, б) и 1×5 000 (в–д)

Таблица 3 – Штаммы бифидобактерий
и источники их выделения
Выделение и идентификация бифидобактерий

Выделение и идентификация бифидобактерий
Таблица 5 – Результаты видовой идентификации бифидобактерий методом двухлокусного секвенирования
Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и гена трансальдолазы
17-ти новых штаммов бифидобактерий депонированы в международной
базе данных GenBank (номера доступа: JN020353–JN020359, JN091120–JN091129,
JN091098–JN091104, JN091110–JN091119)

Выделение и идентификация бифидобактерий
Рисунок 4 – ERIC-ПЦР профили выделенных и коллекционных
штаммов бифидобактерий
а) B. adolescentis: 1 –ВКПМ Ас-1662, 2 – ГО-13, 3 – Н1, B. longum ssp. longum: 4 –ВКПМ Ас-1665,
B. longum ssp. infantis: 5 –ВКПМ Ас-1732, B. longum: 6 – Н3, 7 – А4, 8 – В3, 9 – БИМ В-521;
б) B. animalis ssp. lactis: 1 –ВКПМ Ас-1663, 2 – БИМ В-522, 3 – БИМ В-523,
B. animalis: 4 –H2, 5 –A6, 6 – И1; в) B. pseudolongum ssp. globosum: 1 –ВКПМ Ас-1752,
B. pseudolongum: 2 – С6, 3 – К4, B. boum: 4 –Д3, 5 –Д4, 6 –6, B. thermophilum: 7 –ВКПМ Ас-1746, 8 – 4;
г) B. animalis ssp. animalis: 1 – ВКПМ Ас-1693, 2 – ВКПМ Ас-1747, B. animalis: 3 – K3, 4 – KO3, 5 – KO4, 6 – Д1,
М – маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler 1 kb Plus (Fermentas)

Рисунок 5 – (GTG)5-ПЦР профили выделенных и коллекционных
штаммов бифидобактерий
а) B. longum ssp. longum : 1 – ВКПМ Ас-1665, B. longum : 2 – B379M, 3 – Н3, 4 – А4, 5 – В3,
B. longum ssp. infantis: 6 – ВКПМ Ас-1732, 7 – БИМ В-521; б) B. adolescentis : 1 –ВКПМ Ас-1662,
2 – ГО-13, 3 – Н1, B. boum 4 – 6, 5 – Д3, 6 – Д4; в) B. animalis ssp. lactis: 1 –ВКПМ Ас-1663,
2 – БИМ В-522, 3 – БИМ В-523, 4 –H2, 5 – A6, 6 – И1, B. pseudolongum ssp. globosum : 7 –ВКПМ Ас-1752,
8 – С6, 9 – К4; д) B. animalis ssp. animalis : 1 –ВКПМ Ас-1693, 2 –ВКПМ Ас-1747, 3 – K3, 4 – KO3,
5 – KO4, 6 – Д1, B. thermophilum: 7 –ВКПМ Ас-1746, 8 – 4,
М – маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler 1 kb Plus (Fermentas)
Выделение и идентификация бифидобактерий

Выделение и идентификация бифидобактерий
Рисунок 6 – RAPD-ПЦР профили выделенных и коллекционных
штаммов бифидобактерий
а) B. animalis ssp. lactis: 1 – ВКПМ Ас-1693, 2 – БИМ В-522, 3 – БИМ В-523, 4 – Н2, 5 – А6, 6 – И1,
B. adolescentis: 7 – ВКПМ Ас-1662, 8 – Н1; б) B. pseudolongum ssp. globosum: 1 – ВКПМ Ас-1752,
B. pseudolongum: 2 – С6, 3 – К4, B. thermophilum: 4 – ВКПМ Ас-1746, 5 – 4;
в) B. animalis ssp. animalis :1 – ВКПМ Ас-1663, 2 – ВКПМ Ас-1747,
3 – К3, 4 – Д1, 5 – КО3, 6 – КО4, B. boum: 7 – Д3, 8 – Д4, 9 – 6; г) B. longum ssp. infantis: 1 – ВКПМ Ас-1665,
B. longum ssp. longum: 2 –ВКПМ Ас-1732, B. longum: 3 – В379М, 4 – БИМ В-521, 5 – H3, 6 – В3, 7 – А4,
М – маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler Ladder Mix (Fermentas)

Изучение технологических свойств бифидобактерий

Изучение технологических свойств бифидобактерий
Таблица 6 – Показатели титра клеток и снижения рН среды,
полученные при культивировании выделенных и референтных
штаммов бифидобактерий в питательных средах МРС-Б и БС

Примечание – * - титр клеток и рН на момент образования сгустка, -** – без образования сгустка
Изучение технологических свойств бифидобактерий
Таблица 7 – Время сквашивания, показатели титра клеток
и снижения рН среды, полученные при культивировании выделенных
и референтных штаммов бифидобактерий в коровьем молоке

Изучение технологических свойств бифидобактерий
Таблица 8 – Жизнеспособность выделенных и референтных
штаммов бифидобактерий при хранении при 4 °С
в среде МРС-Б и сквашенном молоке

Рисунок 7 – Выживаемость выделенных и референтных
штаммов бифидобактерий в модельных
условиях пищеварительного тракта
Изучение технологических свойств бифидобактерий

Рисунок 8 – Устойчивость выделенных и референтных штаммов бифидобактерий к высокой температуре (а) и кислороду (б)
Изучение технологических свойств бифидобактерий

Рисунок 9 – Способность выделенных штаммов
бифидобактерий образовывать экзополисахариды
Изучение технологических свойств бифидобактерий
Глюкоза
Лактоза
Сахароза

Таблица 9 – Антагонистическая активность выделенных
и референтных штаммов бифидобактерий по отношению
к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам
Изучение технологических свойств бифидобактерий
Примечание -* – отсутствие ингибирования роста

Изучение технологических свойств бифидобактерий
Ap – ампициллин, Gm – гентамицин, Gr – грамицидин, Lm – линкомицин, Pen – пенициллин ,
Str – стрептомицин, Cm – хлорамфеникол, Tet – тетрациклин, Er –эритромицин
Таблица 10 – Чувствительность выделенных и референтных
штаммов бифидобактерий к антибиотикам,
включенным в перечень EFSA

Положение, выносимое на защиту (2):
Изучение технологических свойств бифидобактерий
Штаммы бифидобактерий, выделенные из фекалий человека и животных, относятся к видам B. adolescentis, B. animalis, B. longum, B. boum, B. pseudolongum, B. thermophilum, по технологическим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым к производственным штаммам, сопоставимы или превосходят штаммы, входящие в состав ряда пробиотиков и кисломолочных продуктов. Применение комплекса методов молекулярного типирования (ERIC-ПЦР, (GTG)5-ПЦР, RAPD-ПЦР) позволяет выявить внутривидовые отличия выделенных культур бифидобактерий и дифференцировать их на уровне штаммов

Селекция и характеристика кислотоустойчивых штаммов бифидобактерий
Рисунок 10 – Выживаемость исследуемых штаммов
бифидобактерий в модельных условиях желудка
(рН 2,0, 180 мин)

Селекция и характеристика кислотоустойчивых штаммов бифидобактерий
Рисунок 11 – Выживаемость бифидобактерий при хранении в питательной среде МРС-Б (а) и сквашенном молоке (б) при 4 °С

Рисунок 12 – Устойчивость кислотоустойчивых и исходных
штаммов бифидобактерий к желчи (а),
высокой температуре (б), кислороду (в)
1 – исходный штамм, 2 – кислотоустойчивый штамм
Селекция и характеристика кислотоустойчивых штаммов бифидобактерий

Положение, выносимое на защиту (3):
Кислотоустойчивые штаммы бифидобактерий B. bifidum БИМ В-465 Д и B. adolescentis БИМ В-462 Д, полученные методом адаптивной селекции, способны расти при рН 4,0, характеризуются высокой выживаемостью в модельных условиях желудка (95–99 %) и сопоставимы по этому признаку с лучшими зарубежными аналогами B. longum ATCC 55816, B. longum BIF12r, а по жизнеспособности при хранении (4 °С) превосходят лучший аналог B. bifidum 791/БАГ (на 11–19 %)
Селекция и характеристика кислотоустойчивых штаммов бифидобактерий

Рисунок 13 – Выживаемость бифидобактерий после криоконсервации
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

Рисунок 14 - Выживаемость бифидобактерий
после криоконсервации
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

Рисунок 15 – Выживаемость бифидобактерий в течение
при хранении методом криоконсервации
а, б, д, е– интактная культура;
в, г, ж, з – культура после криоконсервации;
а–г – электронная микроскопия
(1×8 000 – 10 000);
д–з – световая микроскопия
(1×2 000)
Рисунок 16 – Морфология клеток B. adolescentis БИМ В-87
после 2-х лет хранения методом криоконсервации
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

Рисунок 17 – Динамика развития B. adolescentis БИМ В-87
при глубинном культивировании в питательной среде МРС-Б
после 2-х лет хранения методом криоконсервации
Таблица 11 – Рост B. adolescentis БИМ В-87 в коровьем молоке
после 2-х лет хранения методом криоконсервации
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

Рисунок 18 – Устойчивость B. adolescentis БИМ В-87
к условиям пищеварительного тракта (а),
высокой температуре (б), кислороду (в)
после 2-х лет хранения методом криоконсервации
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий

Положение, выносимое на защиту (4):
Оптимизация условий криоконсервации бифидобактерий
Способ криоконсервации бифидобактерий, особенность которого состоит в использовании в качестве протекторов питательных сред МРС-Б, триптон-лактозной и пептонно-дрожжевой, является технологичным, обеспечивает 95–100 % выживаемость данных микроорганизмов, сохранение их морфологических признаков и физиолого-биохимических свойств

Биотехнологическое применение бифидобактерий
Таблица 12 – Характеристика жидких пробиотиках,
полученных на основе кислотоустойчивых штаммов
B. adolescentis БИМ В-462 Д и B. bifidum БИМ В-465 Д
и исходных коллекционных штаммов

Биотехнологическое применение бифидобактерий
Таблица 13 – Характеристика кисломолочных продуктов,
полученных на основе штаммов бифидобактерий
B. longum БИМ В-647, B. longum БИМ В-648,
B. animalis ssp. lactis БИМ В-643, B. animalis ssp. lactis БИМ В-645

Рисунок 19 – Жизнеспособность исследуемых штаммов бифидобактерий при хранении в сквашенном соевом молоке (4 °С)
Биотехнологическое применение бифидобактерий
Таблица 14 – Показатели титра клеток и снижения рН среды, полученные при культивировании исследуемых штаммов бифидобактерий в соевом молоке

Биотехнологическое применение бифидобактерий
Таблица 15 – Показатели титра клеток и снижения рН среды, полученные при культивировании исследуемых
штаммов бифидобактерий в морковном соке
Таблица 16 – Жизнеспособность исследуемых штаммов бифидобактерий при хранении в морковном соке (4 °С)

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ

Биологически активные вещества,
продуцируемые бифидобактериями
органические кислоты;
бактериоцины и бактериоцин-подобные вещества;
низкомолекулярные вещества;
витамины;
аминокислоты;
пурины и пиримидины;
гидролитические ферменты, расщепляющие сложные углеводы;
внеклеточные полисахариды

Механизмы адаптации бифидобактерий
к неблагоприятным внешним условиям

Ruiz L et al., Genes Nutr. 2011.

Общая характеристика геномов бифидобактерий
Bottacini F. et al., Microbiology, 2010.