Взамод АГ

Содержание

Слайд 2

Будова активного центру антитіл

Будова активного центру антитіл

Слайд 3

Нековалентні зв’язки між антитілом та антигеном

Нековалентні зв’язки між антитілом та антигеном

Слайд 5

АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх

АФІННІСТЬ АНТИТІЛ Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх
взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

Слайд 6

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ]
] [АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ1 - константа швидкості асоціації; κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V1 = k1 ·[АГ] · [АТ] V2= k2 · [АГАТ] За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати: k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ] Константа афінності (2)

=

=

, М-1 або л/моль

Слайд 7

Розрахунок афінності антитіл

Розрахунок афінності антитіл

Слайд 8

Kd=1/ Ka - константа дисоціації;
Ka>105M-1 - cпецифічне зв′язування;
Ka>108M-1 -високоспецифічне зв′язування;
Ka<105M-1- низькоспецифічне

Kd=1/ Ka - константа дисоціації; Ka>105M-1 - cпецифічне зв′язування; Ka>108M-1 -високоспецифічне зв′язування;
(антитіла проти вуглеводів)
Ka- термодинамічний параметр:
Δ F= - R T ln Ka, де R- газова постійна;T- абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

Слайд 9

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ]
] [АГАТ ] АГ – вільний антиген; АТ – вільне антитіло; АГАТ – комплекс антиген-антитіло; κ1 - константа швидкості асоціації; κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ) V1 = k1 ·[АГ] · [АТ] V2= k2 · [АГАТ] За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати: k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ] Константа афінності (2)

=

=

, М-1 або л/моль

Слайд 10

Кінетичні розрахунки

Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу
[АТ]з

Кінетичні розрахунки Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу
= [АТ] +[ АГ·АТ ]
[АГ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3),

де [АТ]з і [АГ]з- загальна концентрація
АТ і АГ,
[ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ,
[АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4)
[ АГ·АТ ] = ка [АТ]з [АГ] / 1+ ка [АГ]

За умови - [АГ]з >> [АТ]з , отримуємо (5)
[ АГ·АТ ]=
ка [АТ]з [АГ]з / 1+ ка [АГ]з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен;
при високих концентраціях [АГ]з
[АГ·АТ] = [АТ]з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

Слайд 11

При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ]'з , при якій половина

При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ]'з , при якій половина
антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ]з /2 . Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ]з'=1/ ка +[АТ]з/2

Слайд 13

Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену; n -

Рівняння Скетчарда: B - концентрація зв'язаного антигену; F - концентрація вільного антигену;
кількість центрів зв'язування антитіл

[АГ·АТ] / [АГ]= ка [АТ]з - ка[АГ·АТ] =
= ка([АТ]з-[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

Слайд 14

Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

Слайд 15

Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

Слайд 17

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО. ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

Слайд 18

Методи імунохімічного аналізу

Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому

Методи імунохімічного аналізу Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при
утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація).
Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації.
Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д.
Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

Слайд 19

Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

Слайд 20

Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах

Методичні підходи, що засновані на зміні

Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах Методичні підходи, що засновані на
фізико-хімічних властивостей антигенів (антитіл) під час утворення комплексу: зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д.
Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

Слайд 21

Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κа =В / F

Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу κа =В / F · (n –B)
· (n –B)

Слайд 22

Рівноважний діаліз

Рівноважний діаліз

Слайд 23

РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

Слайд 24

Характеристика антигенів і антитіл в реакціях преципітації і аглютинації

Характеристика антигенів і антитіл в реакціях преципітації і аглютинації

Слайд 25

Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту

Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл
антигену і антитіл

Слайд 26

Співвідношення концентрацій антигенів і антитіл, коли спостерігається утворення максимального осаду (преципітату), називається

Співвідношення концентрацій антигенів і антитіл, коли спостерігається утворення максимального осаду (преципітату), називається
точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності.

Слайд 28

Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга.

Антитіла преципітують розчинний антиген. Крива Гейдельберга.

Слайд 30

Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д),

Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д),
реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості. Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації -реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

Слайд 32

Реакція преципітації в рідкій фазі

Реакція преципітації в рідкій фазі

Слайд 33

Реакції преципітації в гелі

Реакції преципітації в гелі

Слайд 34

Подвійна імунодифузія- метод Ухтерлоні

Подвійна імунодифузія- метод Ухтерлоні

Слайд 35

Подвійна імунодифузія-метод Ухтерлоні
Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на

Подвійна імунодифузія-метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена
присутність данного антигена

Слайд 36

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні Використовується одна антисироватка і два зразка, які
аналізують на присутність данного антигена

Слайд 37

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

Слайд 38

Проста радіальна імунодифузія.
Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

Слайд 39

Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія. Метод Манчіні.

Слайд 40

Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія.

Проста радіальна імунодифузія. Подвійна імунодифузія.

Слайд 41

Імуноелектрофорез

Імуноелектрофорез

Слайд 44

Реакції гемаглютинації та аглютинації

Реакції гемаглютинації та аглютинації

Слайд 47

Методи аглютинації

Методи аглютинації

Слайд 49

РІА радіоімунний аналіз

Roger Guillemin Andrew V. Schally Rosalyn Yalow

The Nobel Prize in Physiology

РІА радіоімунний аналіз Roger Guillemin Andrew V. Schally Rosalyn Yalow The Nobel
or Medicine 1977 was divided, one half jointly to Roger Guillemin and Andrew V. Schally "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain" and the other half to Rosalyn Yalow "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones".

Слайд 50

Конкурентні імунохімічні методи Amount of label bound to antibody after incubation of constant

Конкурентні імунохімічні методи Amount of label bound to antibody after incubation of
amounts of antibody and labeled antigen

Слайд 51

РІА радіоімунний аналіз

В основі РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену за зв’язування

РІА радіоімунний аналіз В основі РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену
зі специфічними антитілами

Слайд 52

Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для РІА: А — крива насичення

Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для РІА: А — крива насичення зв'язування
зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції зв'язування міченого антигену неміченим і визначення концентрації 'антигену X

Слайд 53

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Слайд 54

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Слайд 55

РІА радіоімун- ний аналіз

РІА радіоімун- ний аналіз

Слайд 56

В - рівень зв’язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125І-АГ; В0 - загальний

В - рівень зв’язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого 125І-АГ; В0 -
рівень радіоактивно-міченого 125І-АГ, внесений в пробірку Естріол – стероїдний гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

Слайд 57

РІА метод

РІА метод

Слайд 59

Cкринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

Cкринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

Слайд 60

Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз

Слайд 62

Групи методів в імуноферментному аналізі

Групи методів в імуноферментному аналізі

Слайд 63

Варианты гомогенного иммуноферментного анализа А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата

Варианты гомогенного иммуноферментного анализа А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С)
(С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело

Слайд 64

КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ (б) ГЕТЕРОГЕННИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ (б) ГЕТЕРОГЕННИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

Слайд 65

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Імуносорбенти
Твердофазні носії
Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій фазі
Ферменти і субстрати
Кон’югати

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Імуносорбенти Твердофазні носії Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій
та їх створення

Слайд 66

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Ферменти і субстрати
Пероксидаза хрону (ПХ)-Нorse radish peroxidase (HRP)-субстрат при фотометрії

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Ферменти і субстрати Пероксидаза хрону (ПХ)-Нorse radish peroxidase (HRP)-субстрат
-тетраметилбензидин
( англ.TMB)
Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії – паранітрофенілфосфат
Галактозидаза-субстрат при фотометрії –нітрофенілгалактозид

Слайд 67

Кон’югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин)

Система “антитіло - біотин + (стрепт)авідин +

Кон’югат з використанням пари біотин- стрепт(авідин) Система “антитіло - біотин + (стрепт)авідин
мічений біотин”

Система “ антиген +антитіло-біотин + мічений стептавідин”

Слайд 69

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон’югату - комплексу антигена і фермента методом гібридних

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон’югату - комплексу антигена і фермента методом гібридних
антитіл. 1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло класу G: дія папаїну і пепсину.

Слайд 70

Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних

Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл.
антитіл.

Слайд 71

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз

Слайд 72

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISA

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз ELISA

Слайд 74

ПРЯМА
ELISА

ПРЯМА ELISА

Слайд 75

Різновиди методу ELISA

Різновиди методу ELISA

Слайд 76

ELISА-Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод

What you need to do

ELISА-Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод What you need
the assay
Purified antigen (if you want to detect or quantify antibody).
Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen).
Standard solutions (positive and negative controls).
Sample to be tested.
Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done.
Wash fluid (buffer).
Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate.
ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

Слайд 77

Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

Слайд 78

ELISA :1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену

1 варіант конкурентної

ELISA :1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену 1 варіант
ELISA 2 варіант цього ж методу
1
2

Слайд 79

Метод визначення антигенів

Метод визначення антигенів

Слайд 80

ELISA Activity

An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA) is

ELISA Activity An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA)
the first and most basic test to determine if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed.

Plate ELISA

Слайд 81

The ELISA Method

Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA
plate

Patient

The ELISA Method Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA
serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.

Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.

Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

Слайд 82

Positive ELISA Test

Negative ELISA Test

Positive ELISA Test Negative ELISA Test

Слайд 83

Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical

Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical
density at 450 nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis

ELISA Activity
ELISA data from three patients

Слайд 84

Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2

Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2

Слайд 85

Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- Сell Death Detection ELISA PLUS

Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі- Сell Death Detection ELISA
Kit панель А-приготування проб; панель В- власне ELISA

Слайд 86

Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

Метод імунофлуоресценції ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження- 450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

Слайд 87

Метод імунофлуоресценції

Метод імунофлуоресценції

Слайд 88

Проточний цитофлуориметр (клітинний сортер)

Проточний цитофлуориметр (клітинний сортер)

Слайд 89

Проточна цитометрія

Проточна цитометрія

Слайд 90

Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

Слайд 91

Рис. Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів тимусу (А) та селезінки (Б) щурів за дії

Рис. Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів тимусу (А) та селезінки (Б) щурів за дії
іонізуючої радіації:
1 - контроль; 2 - 1,0 Гр (30 хв після опромінення); 3 – 1,0 Гр (3 год після опромінення);4 – 7,78 Гр (30 хв після опромінення); 5 – 7,78 Гр (3 год після опромінення)
*- достовірно у відношенні до контролю, Р ≤ 0,05

А

Б

*

*

*

*

*

*

*

Апоптотичні клітини, %

Апоптотичні клітини, %

Слайд 92

ІМУНОБЛОТИНГ (Western blotting )

ІМУНОБЛОТИНГ (Western blotting )

Слайд 94

ВІЗУАЛІЗАЦІЯ

ВІЗУАЛІЗАЦІЯ

Слайд 95

Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus

Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus
(HIV) in serum from infected individuals

Слайд 96

Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control

Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject
subject

Слайд 97

Будова вірусу імунодефіциту людини

Будова вірусу імунодефіциту людини

Слайд 98

No bands presentNegativeBands at either p31 OR p24 AND bands present at

No bands presentNegativeBands at either p31 OR p24 AND bands present at
either gp160 OR gp120PositiveBands present, but pattern does not meet criteria for positivityIndeterminate

Band pattern Interpretation
Lane 1, HIV+ serum (positive control)
Lane 2, HIV- serum (negative control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C

Слайд 99

Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при

Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при
переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

Слайд 100

Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі

Можливі 2 варіанти
при

Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі Можливі 2 варіанти при
аналізі по прямій схемі перексид водню окислює люмінол
(+ пероксидаза);
по непрямій схемі- антиген мітиться хемілюмінесціюючою групою (люмінолом чи його похідними). Така мітка у вільному стані окислюється з виділенням світла. У разі утворення комплексу з антитілом, вона втрачає можливість окислюватись, отже світіння буде відсутнє. В цьому випадку інтенсивність сигналу пропорційна тій кількості мітки, якій антиген не дав зв’язатись з антитілом.
Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL- метод (Enhanced Chemiluminescence). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню , що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

Слайд 103

Метод ELISPOT а) методичний підхід,б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів

Метод ELISPOT а) методичний підхід,б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації
детекції відразу двох різних цитокінів

Слайд 104

Метод ELISPOT

The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by

Метод ELISPOT The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by
the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN-γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots..
Имя файла: Взамод-АГ-.pptx
Количество просмотров: 184
Количество скачиваний: 0