Взамод АГ

Будова активного центру антитіл

Нековалентні зв’язки між антитілом та антигеном

АФІННІСТЬ АНТИТІЛ
Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [АГАТ ] АГ – вільний антиген;
АТ – вільне антитіло;
АГАТ – комплекс антиген-антитіло;
κ1 - константа швидкості асоціації;
κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ)
V1 = k1 ·[АГ] · [АТ]
V2= k2 · [АГАТ]
За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати:
k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ]
Константа афінності
(2)
=
=
, М-1 або л/моль

Розрахунок афінності антитіл

Kd=1/ Ka - константа дисоціації;
Ka>105M-1 - cпецифічне зв′язування;
Ka>108M-1 -високоспецифічне зв′язування;
Ka<105M-1- низькоспецифічне (антитіла проти вуглеводів)
Ka- термодинамічний параметр:
Δ F= - R T ln Ka, де R- газова постійна;T- абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [АГАТ ] АГ – вільний антиген;
АТ – вільне антитіло;
АГАТ – комплекс антиген-антитіло;
κ1 - константа швидкості асоціації;
κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ)
V1 = k1 ·[АГ] · [АТ]
V2= k2 · [АГАТ]
За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати:
k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ]
Константа афінності
(2)
=
=
, М-1 або л/моль

Кінетичні розрахунки
Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу
[АТ]з = [АТ] +[ АГ·АТ ]
[АГ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3),
де [АТ]з і [АГ]з- загальна концентрація
АТ і АГ,
[ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ,
[АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4)
[ АГ·АТ ] = ка [АТ]з [АГ] / 1+ ка [АГ]
За умови - [АГ]з >> [АТ]з , отримуємо (5)
[ АГ·АТ ]=
ка [АТ]з [АГ]з / 1+ ка [АГ]з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен;
при високих концентраціях [АГ]з
[АГ·АТ] = [АТ]з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ]'з ,
при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ]з /2 . Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ]з'=1/ ка +[АТ]з/2

Рівняння Скетчарда:
B - концентрація зв'язаного антигену;
F - концентрація вільного антигену;
n - кількість центрів зв'язування антитіл
[АГ·АТ] / [АГ]= ка [АТ]з - ка[АГ·АТ] =
= ка([АТ]з-[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО.
ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

Методи імунохімічного аналізу
Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація).
Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації.
Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д.
Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах
Методичні підходи, що засновані на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів (антитіл) під час утворення комплексу: зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д.
Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу
κа =В / F · (n –B)

Рівноважний діаліз

РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

Характеристика антигенів і антитіл в реакціях преципітації і аглютинації

Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл

Співвідношення концентрацій антигенів і антитіл, коли спостерігається утворення максимального осаду (преципітату), називається точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності.

Антитіла преципітують розчинний антиген.
Крива Гейдельберга.

Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості.
Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації -реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

Реакція преципітації в рідкій фазі

Реакції преципітації в гелі

Подвійна імунодифузія-
метод Ухтерлоні

Подвійна імунодифузія-метод Ухтерлоні
Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні
Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

Проста радіальна імунодифузія.
Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія.
Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія.
Подвійна імунодифузія.

Імуноелектрофорез

Реакції гемаглютинації та аглютинації

Методи аглютинації

РІА
радіоімунний аналіз
Roger Guillemin Andrew V. Schally Rosalyn Yalow
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977 was divided, one half jointly to Roger Guillemin and Andrew V. Schally "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain" and the other half to Rosalyn Yalow "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones".

Конкурентні імунохімічні методи
Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and labeled antigen

РІА
радіоімунний аналіз
В основі РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену за зв’язування зі специфічними антитілами

Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для РІА: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції зв'язування міченого антигену неміченим і визначення концентрації 'антигену X

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Різні методи побудови калібрувальних кривих

РІА
радіоімун-
ний аналіз

В - рівень зв’язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого
125І-АГ;
В0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125І-АГ, внесений в пробірку
Естріол – стероїдний гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

РІА метод

Cкринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

Імуноферментний аналіз

Групи методів в імуноферментному аналізі

Варианты гомогенного иммуноферментного анализа А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело

КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ (б) ГЕТЕРОГЕННИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ
Імуносорбенти
Твердофазні носії
Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій фазі
Ферменти і субстрати
Кон’югати та їх створення

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ
Ферменти і субстрати
Пероксидаза хрону (ПХ)-Нorse radish peroxidase (HRP)-субстрат при фотометрії -тетраметилбензидин
( англ.TMB)
Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії – паранітрофенілфосфат
Галактозидаза-субстрат при фотометрії –нітрофенілгалактозид

Кон’югат з використанням пари
біотин- стрепт(авідин)
Система “антитіло - біотин + (стрепт)авідин + мічений біотин”
Система “ антиген +антитіло-біотин + мічений стептавідин”

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон’югату - комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл.
1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло класу G: дія папаїну і пепсину.

Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл.

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз
ELISA

ПРЯМА
ELISА

Різновиди методу ELISA

ELISА-Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод
What you need to do the assay
Purified antigen (if you want to detect or quantify antibody).
Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen).
Standard solutions (positive and negative controls).
Sample to be tested.
Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done.
Wash fluid (buffer).
Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate.
ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

ELISA :1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену
1 варіант конкурентної ELISA 2 варіант цього ж методу
1
2

Метод визначення антигенів

ELISA Activity
An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA) is the first and most basic test to determine if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed.
Plate ELISA

The ELISA Method
Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA
plate
Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.
Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

Positive ELISA Test
Negative ELISA Test

Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical density at 450 nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis
ELISA Activity
ELISA data from three patients

Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2

Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі-
Сell Death Detection ELISA PLUS Kit
панель А-приготування проб;
панель В- власне ELISA

Метод імунофлуоресценції
ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження-
450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

Метод імунофлуоресценції

Проточний цитофлуориметр (клітинний сортер)

Проточна цитометрія

Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

Рис. Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів тимусу (А) та селезінки (Б) щурів за дії іонізуючої радіації:
1 - контроль; 2 - 1,0 Гр (30 хв після опромінення); 3 – 1,0 Гр (3 год після опромінення);4 – 7,78 Гр (30 хв після опромінення); 5 – 7,78 Гр (3 год після опромінення)
*- достовірно у відношенні до контролю, Р ≤ 0,05
А
Б
*
*
*
*
*
*
*
Апоптотичні клітини, %
Апоптотичні клітини, %

ІМУНОБЛОТИНГ (Western blotting )

ВІЗУАЛІЗАЦІЯ

Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals

Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject

Будова вірусу імунодефіциту людини

No bands presentNegativeBands at either p31 OR p24 AND bands present at either gp160 OR gp120PositiveBands present, but pattern does not meet criteria for positivityIndeterminate
Band pattern Interpretation
Lane 1, HIV+ serum (positive control)
Lane 2, HIV- serum (negative control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C

Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі
Можливі 2 варіанти
при аналізі по прямій схемі перексид водню окислює люмінол
(+ пероксидаза);
по непрямій схемі- антиген мітиться хемілюмінесціюючою групою (люмінолом чи його похідними). Така мітка у вільному стані окислюється з виділенням світла. У разі утворення комплексу з антитілом, вона втрачає можливість окислюватись, отже світіння буде відсутнє. В цьому випадку інтенсивність сигналу пропорційна тій кількості мітки, якій антиген не дав зв’язатись з антитілом.
Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL- метод (Enhanced Chemiluminescence). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню , що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

Метод ELISPOT
а) методичний підхід,б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів

Метод ELISPOT
The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN-γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots..