Взамодействие АГ

Будова активного центру антитіл

Нековалентні зв’язки між антитілом та антигеном

АФІННІСТЬ АНТИТІЛ
Афінністю або спорідненістю антитіл до антигену називають результуючу силу їх взаємодій, яка є сумою сил притягання та відштовхування, що діють між активним центром АТ і епітопом АГ. Афінність відображає здатність антитіл формувати стабільні імунні комплекси.

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [АГАТ ] АГ – вільний антиген;
АТ – вільне антитіло;
АГАТ – комплекс антиген-антитіло;
κ1 - константа швидкості асоціації;
κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ)
V1 = k1 ·[АГ] · [АТ]
V2= k2 · [АГАТ]
За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати:
k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ]
Константа афінності
(2)
=
=
, М-1 або л/моль

Розрахунок афінності антитіл

Kd=1/ Ka - константа дисоціації;
Ka>105M-1 - cпецифічне зв′язування;
Ka>108M-1 -високоспецифічне зв′язування;
Ka<105M-1- низькоспецифічне (антитіла проти вуглеводів)
Ka- термодинамічний параметр:
Δ F= - R T ln Ka, де R- газова постійна;T- абсолютна температура (Кельвін); Δ F - зміна вільної енергії взаємодії АГ-АТ.

(1) хімічна реакція першого порядку [ АГ ] + [ АТ ] [АГАТ ] АГ – вільний антиген;
АТ – вільне антитіло;
АГАТ – комплекс антиген-антитіло;
κ1 - константа швидкості асоціації;
κ2 - константа швидкості дисоціації комплексу антиген-антитіло (АГАТ)
V1 = k1 ·[АГ] · [АТ]
V2= k2 · [АГАТ]
За умов рівноваги, коли V1 = V2 , можна записати:
k1· [АГ][АТ] = k2·[АГАТ]
Константа афінності
(2)
=
=
, М-1 або л/моль

Кінетичні розрахунки
Згідно з (1) та (2) і системою рівнянь матеріального балансу
[АТ]з = [АТ] +[ АГ·АТ ]
[АГ]з = [АГ] +[ АГ·АТ ] (3),
де [АТ]з і [АГ]з- загальна концентрація
АТ і АГ,
[ АГ·АТ ] - концентрація зв’язаних АТ чи АГ,
[АТ] і [АГ]- концентрація вільних АТ чи АГ, одержуємо (4)
[ АГ·АТ ] = ка [АТ]з [АГ] / 1+ ка [АГ]
За умови - [АГ]з >> [АТ]з , отримуємо (5)
[ АГ·АТ ]=
ка [АТ]з ·[АГ]з / 1+ ка [АГ]з - аналог рівняння Міхаеліса-Ментен;
при високих концентраціях [АГ]з
[АГ·АТ] = [АТ]з – концентрація комплексу спрямована до загальної концентрації антитіл (графік).

При розрахунку Ка визначають таку концентрацію антигену [АГ]'з ,
при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном [АГ·АТ] = [АТ]з /2 . Враховуючи (3) і (4), отримуємо (6): [АГ]з'=1/ ка +[АТ]з/2

Рівняння Скетчарда:
B - концентрація зв'язаного антигену;
F - концентрація вільного антигену;
n - кількість центрів зв'язування антитіл
[АГ·АТ] / [АГ]= ка [АТ]з - ка[АГ·АТ] =
= ка([АТ]з-[АГ·АТ]) - згідно з рівняннями 1, 2, 5

Графік Скетчарда для моноклональних (А) і поліклональних (Б) антитіл

Графік Скетчарда для моноклональних і поліклональних антитіл

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИГЕН-АНТИТІЛО.
ІМУНОХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ.

Методи імунохімічного аналізу
Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому утворюються, ідентифікують візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами (пряма гемаглютинація).
Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це - методи пасивної (непрямої) гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації.
Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних), для виявлення реакції антиген-антитіло. Це - імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз, імунохроматографічний аналіз і т.д.
Метод імуносенсорів та метод генного зондування (Fish method).

Чутливість різних імунохімічних методів досліджень

Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах
Методичні підходи, що засновані на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів (антитіл) під час утворення комплексу: зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д.
Розділення вільного і зв'язаного антигену, яке відбувається з залученням методів фракційного осадження (центрифугування), рівноважного діалізу, гель-фільтрації.

Рівноважний діаліз. Визначення афінності антитіл методом рівноважного діалізу
κа =В / F · (n –B)

Рівноважний діаліз

РЕАКЦІЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ

Характеристика антигенів і антитіл , що утворюють комплекси в реакціях преципітації і аглютинації

Крива преципітації Гейдельберга і типи утворених імунних комплексів при різних співвідношеннях вмісту антигену і антитіл

Співвідношення концентрацій антигенів і антитіл, коли спостерігається утворення максимального осаду (преципітату), називається точкою еквівалентності реакції. Мінімальні і максимальні значення співвідношень АГ/АТ, в межах яких ще спостерігаються доступні оку осади, визначають як зону еквівалентності.

Антитіла преципітують розчинний антиген.
Крива Гейдельберга.

Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості.
Реакції преципітації використовують для високодисперсних антигенів, які визначаються окремими молекулами. На відміну від реакцій аглютинації реакція утворення осаду в реакції преципітації йде досить повільно, сам преципітат має нижчу щільність і може з часом дисоціювати.

Реакція преципітації в рідкій фазі

Реакції преципітації в гелі

Подвійна імунодифузія-
метод Ухтерлоні

Подвійна імунодифузія-метод Ухтерлоні
Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність даного антигена

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні
Використовується одна антисироватка і два зразка, які аналізують на присутність данного антигена

Подвійна імунодифузія - метод Ухтерлоні

Проста радіальна імунодифузія.
Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія.
Метод Манчіні.

Проста радіальна імунодифузія.
Подвійна імунодифузія.

Імуноелектрофорез

Реакції (гем)аглютинації
Реакції аглютинації – осадження антитілами корпускулярних антигенів (клітин, вірусних часточок і т.д), реакції преципітації- осадження молекул, що мають антигенні властивості.

Методи аглютинації

Конкурентні імунохімічні методи
Amount of label bound to antibody after incubation of constant amounts of antibody and labeled antigen

РІА
радіоімунний аналіз
В основі класичного РІА – конкуренція міченого і неміченого антигену за зв’язування зі специфічними антитілами

Аналіз зв'язування антигену з антитілом. Для РІА: А — крива насичення зв'язування міченого (*) антигену з постійною кількістю антитіл. В — крива конкуренції зв'язування міченого і неміченого антигену і визначення концентрації досліджуваного антигену X ( [АГ]х )

Різні методи побудови калібрувальних кривих

Різні методи побудови калібрувальних кривих

РІА
радіоімун-
ний аналіз

В - рівень зв’язаного в результаті реакції АГ-АТ міченого
125І-АГ;
В0 - загальний рівень радіоактивно-міченого 125І-АГ, внесений в пробірку
Естріол – стероїдний гормон, різкі зміни рівня якого при вагітності можуть свідчити про порушення у розвитку плоду

РІА метод

Прикладом використання РІА можуть бути методи для тестування алергійних станів у людини

Cкринінг донорської крові на присутність вірусу гепатиту В методом твердофазного РІА

ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

Групи методів в імуноферментному аналізі

КОНКУРЕНТНИЙ (а) ТА НЕКОНКУРЕНТНИЙ (б) ГЕТЕРОГЕННИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ
Імуносорбенти
Твердофазні носії
Імобілізація антигенів чи антитіл на твердій фазі
Ферменти і субстрати
Кон’югати та їх створення

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ
Ферменти і субстрати
Пероксидаза хрону (ПХ)-Нorse radish peroxidase (HRP).
Субстрати при фотометрії - тетраметилбензидин (англ.TMB) та ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
Лужна фосфатаза – субстрат при фотометрії – паранітрофенілфосфат
Галактозидаза- субстрат при фотометрії –нітрофенілгалактозид

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз
ELISA

Кон’югат з використанням пари
біотин- стрепт(авідин)
Система “антитіло - біотин + (стрепт)авідин + мічений біотин”
Система “ антиген +антитіло-біотин + мічений стрептавідин”

ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ Отримання кон’югату - комплексу антигену і фермента методом гібридних антитіл.
1 етап - накопичення протеолітичних фрагментів. Антитіло класу G: дія папаїну і пепсину.

Отримання комплексу антигена і фермента методом гібридних антитіл. 2етап- власне створення гібридних антитіл.

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз

ELISА- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз
ELISA

ПРЯМА
ELISА

Різновиди методу ELISA

ELISА-Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Сорбційний імуноферментний аналіз (1) непрямий метод
What you need to do the assay
Purified antigen (if you want to detect or quantify antibody).
Purified antibody (if you want to detect or quantify antigen).
Standard solutions (positive and negative controls).
Sample to be tested.
Microtiter dishes: plastic trays with small wells in which the assay is done.
Wash fluid (buffer).
Enzyme-labeled antibody and enzyme substrate.
ELISA reader (spectrophotometer) for quantitative measurements.

Метод визначення антитіл (непряма ELISA)

ELISA :1- сандвіч-метод визначення антигену ; 2-конкурентний метод визначення антигену
1 варіант конкурентної ELISA 2 варіант цього ж методу
1
2

Метод визначення антигенів

Будова вірусу імунодефіциту людини

Віріони ВІЛ мають вид сферичних часточок, діаметр яких складає приблизно 100—120 нм. Оболонка утворена подвійним шаром ліпідів і містить ряд білків, її походження - від зовнішньої мембрани клітини-господаря. Отже, відбруньковуючись, вірус може захопити частину зовнішньої мембрани клітини-господаря, що містить “експресовані” на ній молекули МНС, а саме людські лейкоцитарні антигени HLA класів I, II і молекули адгезії. Завдяки цьому певна частина пацієнтів, які проходять тест на наявність антитіл до ВІЛ з використанням методу ELISA, може мати хибно-позитивні результати (false positive), оскільки мають антитіла проти молекул HLA, які також є на мембрані клітини-хазяїна (0,02-0,5%). Хибно-негативні (false negative) результати можуть бути отримані, якщо сироватки пацієнтів були в стадії сероконверсії – зазору = віконця (window) у часі між інфікуванням і напрацюванням специфічних антитіл до вірусу (3 — 5%) .
Хибно-позитивні результати
“For instance, some, but not all, people who have had blood transfusions, prior pregnancies or an organ transplant will make HLA antibodies. And some, but not all, test kits (both ELISA and Western blot) will be contaminated with HLA antigens to which these antibodies can react. Only if these two conditions coincide might you get a false-positive due to HLA cross-reactivity”.

ELISA Activity
(n_animation.mov, p_animation 1.mov)
An HIV ELISA, sometimes called an HIV enzyme immunoassay (EIA) is the first and most basic test to determine if an individual is positive for a selected pathogen, such as HIV. The test is performed in a 8 cm x 12 cm plastic plate which contains an 8 x 12 matrix of 96 wells, each of which are about 1 cm high and 0.7 cm in diameter. The next page illustrates how an HIV ELISA is performed.
Plate ELISA

The ELISA Method (n_animation.mov, p_animation 1.mov)
Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA
plate
Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.
Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

Positive ELISA Test
Negative ELISA Test

Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical density at 450 nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis
ELISA Activity
ELISA data from three patients

Перша російська тест-система для виявлення сумарних антитіл до ВІЛ-1,2 (1999)

Використання методу ELISA для детекції рівня клітинної загибелі-
Сell Death Detection ELISA PLUS Kit
панель А-приготування проб;
панель В- власне ELISA

p53 pan ELISA-оne-step immunoreaction – Photometric enzyme immunoassay for the quantification of p53 in cells, homogenates, plasma, or serum
Contents
Anti-human-p53 pan-peroxidase (POD), polyclonal from sheep, lyophilizate
Human p53 standards, lyophilized (six vials, from 0 pg/ml up to 1,200 pg/ml; see lot-specific data)
Incubation Buffer/Sample Diluent, 50 ml, ready-to-use solution
10x Washing Buffer, 100 ml
TMB Substrate Solution, 26 ml, ready-to-use
TMB Stop Solution, 8 ml, ready-to-use
Streptavidin-coated Microplate, 96-well; 8-well modules in a frame, precoated with anti-p53-biotin monoclonal antibody from mouse
Self-Adhesive Plate Cover Foils, 2 foils
Principle
The p53 pan ELISA assay is based on the quantitative “sandwich enzyme-immunoassay” principle using two monoclonal antibodies directed against human p53. During a one-step incubation in the precoated wells of the microplate, p53 from the sample binds to the plate surface, and the peroxidase (POD)-conjugated detection antibody interacts with the immobilized p53. Following a washing step, the POD bound within the “sandwich” complex is detected with the colorimetric substrate tetramethylbenzidine (TMB), and levels are spectrophotometrically determined. The kit provides standards with defined concentrations of p53, allowing for the creation of a standard calibration curve; unknown sample values are calculated from this plot.
Figure 1: Test principle.
Typical Experiment
Figure 2: Typical standard curve, plotted with each experiment, and used for the calibration of prediluted
serum samples.

Метод імунофлуоресценції

Флуоресцентне випромінювання
Деякі речовини здатні поглинати фотони певної енергії (довжини хвилі) при опроміненні світлом певної довжини хвилі. Світло (фотони), що випромінюється ними потім, має нижчу енергію й, отже, більшу довжину хвилі і в зв’язку з цим інший колір cвітла. Таким чином виділяють хвилю збудження (excitation) або спектр поглинання та хвилю випромінення=емісії (emission =испускать = emit). Таке випромінювання світла називається флуоресценцією.

В 1944 р. Albert Coons показав, що антитіла можна мітити молекулами, які флуоресціюють. Коли молекула антитіла зв’язується з флуоресцентним барвником (флуорохромом), імунний комплекс, що містить це мічене антитіло, можна детектувати за рахунок емісії після збудження світлом певної довжини хвилі. Цю детекцію (світло, яке випромінюють після збудження флуорохроми) проводять з використанням флуоресцентного мікроскопа, який має у своєму складі джерело УФ – випромінення, або проточного цитофлуориметра, що містить лазер. Саме такий підхід отримав загальну назву “Методи з використанням імунофлуоресценції”.

Fluorescence spectra of commonly used fluorochromes. Excitation spectra is represented by the gray lines while emission spectra is in black. The bottom part of the table summarizes the emission wavelengths of various light sources used in flow cytometry. The 488nm line of the argon ion laser is extended over the spectra. (From Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro. P. 245).

Флуоресцеїн (Fluorescein )- органічний барвник, який широко використовують в імунофлуоресценції. Хвиля збудження в діапазоні синього світла (490 нм) і емісії- зелено-жовтому діапазоні (517 нм).
Флуоресцеїн - ізотіоціанат (ФІТЦ), Fluorescein isothiocyanate(FITC) похідне флуоресцеїну, широко використовується як флуоресцентний барвник. ФІТЦ збуджується синім світлом (494-495 нм) і випромінює в зелено-жовтому діапазоні (518- 521 нм ).
Родамін (Rhodamine) - органічний барвник, збуджується в жовто-зеленому діапазоні (515 нм) і випромінює в червоному діапазоні (546 нм ). Оскільки його хвиля емісії лежить в більш довгохвильовому діапазоні, то саме він може бути використаним в імунофлуоресцентному аналізі з застосуванням двох барвників. Так, антитіло, специфічне до однієї антигенної детермінанти, мітиться флуоресцеїном, в той час як інше- родаміном. Локалізацію флуоресцеїн- міченого антигену візуалізують в жовто-зеленому діапазоні, і її легко відрізнити від емісії в червоному діапазон при зв’язуванні антигену з міченими родаміном антитілами. Саме таким чином можна візуалізувати два різних мембрано-зв’язані антигени на поверхні однієї і тієї ж клітини.
Фікоеритрин (Phycoerythrin=PE) – високофлуоресцентний пігмент, який отримують з водоростей, хвиля збудження -565 нм - синя область, емісії- 575 нм - червона область спектра. Його вважають ~ в 30 раз ефективнішим, ніж флуоресцеїн.
DAPI- 4,6-diamedine-2-phenylindole-dihydrochloride – хвиля збудження/емісії- 358/461нм- ДНК-звязуючий барвник, ядра яскраво блакитні.
Пропідій йодид (РІ)- хвиля збудження/емісії- 535/617 нм - ДНК-звязуючий барвник, ядра червоні.

Метод імунофлуоресценції
ФІТЦ- флуоресцеїн-ізотіоціанат- довжина хвилі збудження-
450-500 нм, випромінення (емісії)-500-550 нм

Метод імунофлуоресценції

Протоковий цитофлуориметр (клітинний сортер)

Протоковий цитофлуориметр (клітинний сортер)

Протоковий цитофлуориметр

Світлорозсіювання
Клітини, які проходять через лазерний промінь, розсіюють (відбивають) світло
Тінь, яку створює клітина, називається прямим світлорозсіюванням
Також можливе розсіювання в інших напрямах
Детектори, які реєструють пряме світлорозсіювання (FSS– Forward Scatter Sensor), розташовані навпроти лазерного променя, а ті, що реєструють бічне світлорозсіювання (SSS– Side Scatter Sensor), – під кутом 90° до лазерного променя

Пряме світлорозсіювання
По значенню сигналу прямого світлорозсівання можна оцінити розмір (тобто об'єм) клітини
Великі клітини, наприклад, нейтрофіли, відкидають великі тіні; у менших по розміру клітин, наприклад, лімфоцитів, і тіні менші.

Бічне світлорозсіювання
Бічне світлорозсіювання, або ортогональне, є мірою неоднорідності внутрішньої структури клітини (наприклад, зернистості цитоплазми)
Нейтрофіли з сегментованим ядром і високогранулярною цитоплазмою характеризуються високими показниками бічного світлорозсіювання
Лімфоцити, які характеризуються високим ядерно-цитоплазматичним співвідношенням (невисокий вміст цитоплазми), мають нижчі показниками бічного світлорозсіювання

Протокова цитометрія

Флуоресценція при протоковій цито(флуоро) метрії та методи її реєстрації
При протоковій цитофлуориметрії клітини мітять одним чи декількомами флуорохромами. Випромінення кожного флуорохрому можливо зареєструвати окремо, використовуючи відповідні фільтри.
Детектори флуоресценції розташовані під кутом 90° до осі променя поряд з детекторами бічного світлорозсіювання.
Може працювати від 2 до 13 детекторів флуоресценції (FLS= Fluorescence light Sensor).
Ці детектори складаються з фотоелектронних помножувачів (ФЕУ), що підсилююють низькі сигнали флуоресценції клітин, які мечені флуоресцентно.

Виокремлення популяції лімфоцитів
Необхідно мати суспензію лімфоцитів;
антитіла до CD8, мічені флуоресцентним барвником.
На трьохмірній діаграмі
(рис. б) показані розміри
(s), число ( n) і флуоресценцію
(f) лімфоцитів цілої клітинної популяції і популяції CD 8+, які отримані на клітинному сортері з використанням
анти- CD 8
антитіл

Проточно-цитофлуориметричний аналіз лімфоцитів

ІМУНОБЛОТИНГ (Western blotting )

Люмінесценцією називають природне світіння, що супроводжує ряд біохімічних реакцій, і виникає при переході збуджених молекул в основний електронний стан. Підсилення процесу за рахунок окиснення перекисом водню люмінолу і деяких його похідних з залученням пероксидази чи каталази - хемілюмінісценція

Використання хемілюмінесцентних підходів в імуно - блот аналізі
Насьогодні широко використовується метод посиленної хемілюмінесценції ECL- метод (Enhanced Chemiluminescence). В реакції пероксидаза хрону, коньюгована з вторинними антитілами, каталізує окиснення люмінолу до діаніону при додаванні перексиду водню, що пов’язано з емісією квантів світла. Чутливість реакції посилюється при додаванні фенольної похідної – кумарової кислоти. Візуалізація результатів відбувається з використанням рентгенівської плівки, з подальшим її проявленням.

Western blotting is used to identify antibodies to the human immunodeficiency virus (HIV) in serum from infected individuals
The virus is dissociated into its constituent proteins by treatment with the detergent SDS, and its proteins are separated using SDS-PAGE. The separated proteins are transferred to a nitrocellulose sheet and reacted with the test serum. Anti-HIV antibodies in the serum bind to the various HIV proteins and are detected with enzyme-linked anti-human immunoglobulin, which deposits colored material from a colorless substrate. This general methodology will detect any combination of antibody and antigen and is used widely, although the denaturing effect of SDS means that the technique works most reliably with antibodies that recognize the antigen when it is denatured.
Застосування імуноблотингу (Western blotting) для виявлення антитіл до ВІЛ

Western blots of serum samples from two HIV-infected individuals and one control subject

Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ, 1991) рекомендует следующую оценку результатов исследований, проведенных методом ИБ, а именно наличие полос на определённых участках нитроцеллюлозной пластины,что подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ :
Положительный результат — обнаружение в сыворотке антител к двум вирусным белкам из группы env (gp41 -TM, transmembrane; gp120 - SU, surface; gp 160 - SU; gp 36 –SU, характерный для ВИЧ-2) с наличием или отсутствием белков — продуктов других структурных генов gag (p24 - CA, capsid) и pol (р31- Іnt, integrase).
Отрицательный результат — отсутствие антител к вирусоспецифическим белкам;
Неопределенный результат — обнаружение в сыворотке антител к белкам из групп gag или pol.
Трактовка результата.. При исследовании методом ИБ обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для ИБ на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата.

Будова вірусу імунодефіциту людини

Band pattern Interpretation
Lane 1, HIV+ serum (positive control)
Lane 2, HIV- serum (negative control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C

Визначення присутності грампозитивних бактерій класу спірохет Borrelia burgdorferi, які спричиняють хворобу Лайма, методом імуноблотингу

Метод ELISPOT
а) методичний підхід, б) візуалізація результатів, в) лунка планшета після візуалізації результатів детекції відразу двох різних цитокінів

Метод ELISPOT
The frequency of cytokine-secreting T cells can be determined by the ELISPOT assay. The ELISPOT assay is a variant of the ELISA assay in which antibodies bound to a plastic surface are used to capture cytokines secreted by individual T cells. Usually, cytokine specific antibodies are bound to the surface of a plastic tissue-culture well and the unbound antibodies are removed (top panel). Activated T cells are then added to the well and settle onto the antibody-coated surface (second panel). If a T cell is secreting the appropriate cytokine, this will then be captured by the antibody molecules on the plate surrounding the T cell (third panel). After a period of time the T cells are removed, and the presence of the specific cytokine is detected using an enzyme-labeled second antibody specific for the same cytokine. Where this binds, a colored reaction product can be formed (fourth panel). Each T cell that originally secreted cytokine gives rise to a single spot of color, hence the name of the assay. The results of such an ELISPOT assay for T cells secreting IFN-γ in response to different stimuli are shown in the last panel. In this example, T cells from a patient with melanoma were stimulated with the mitogen PHA (top left), a peptide from cytomegalovirus (top right), a peptide from a melanoma tumor associated antigen (lower left), and with no peptide (lower right). You can see the greater response to the cytomegalovirus peptide compared to the melanA peptide by the greater number of spots..