Характеристика гена целлюлазы Pectobacterium carotovorum

Pectobacterium carotovorum
Бактерии Pectobacterium carotovorum наносят значительный ущерб растениям картофеля, вызывая заболевание «черная ножка» (заболевание, приводящее к гибели растения вскоре после прорастания клубней), а также мягкую гниль клубней при хранении.

Основными факторами вирулентности для Pectobacterium считаются:
внеклеточные пектатлиазы
внеклеточные целлюлазы
внеклеточные протеазы

Предполагается, что целлюлаза является одним из основных факторов вирулентности Pectobacterium carotovorum. Молекулы целлюлазы состоят из субстратсвязывающего домена на С-конце, соединенного с помощью короткого полилинкерного участка с каталитическим доменом на N-конце.
Ген целлюлазы celV кодирует эндоглюконазу семейства 5
Целлюлаза – фактор вирулентности Pectobacterium carotovorum

Цель работы:
создание мутанта Pectobacterium carotovorum 3-2 по гену целлюлазы (celV) и оценка роли этого гена в вирулентности бактерий Pca.

Схема получения мутантного штамма
P. carotovorum по гену celV
‘celV’

Создание мутанта Pectobacterium carotovorum 3-2 по гену целлюлазы (celV)
Чашечный тест на продукцию секретируемой целлюлазы клетками штамма Pca JN42 (сектор 1) и его мутантов BA1 (сектор 2), BA2 (сектор 3), ВА3 (сектор 4).
Электрофореграмма продуктов амплификации хромосомной ДНК штаммов Pca BA1 (дорожки 1 и 5), BA2 (дорожки 2 и 6), ВА3 (дорожки 3 и 7) с использованием праймеров сel1, cel2 и M13/pUC sequencing primer (дорожки 1-3) или сel1, cel2 и M13/pUC reverse sequencing primer (дорожки 5-7) при температуре отжига 50°С. Дорожка 4 - ДНК-маркер (Fermentas#SM0311).

Проверка вирулентности штаммов, мутантных по гену целлюлазы, при заражении клубней картофеля
Среднее значение веса мацерированной ткани клубней картофеля сортов Скарб и Живица, зараженных бактериями штаммов Pca JN42, BA1, BA2 и BA3.

Проверка вирулентности штаммов, мутантных по гену целлюлазы, при заражении стеблей картофеля
Оценка симптомов поражения «черной ножкой» стеблей картофеля сорта Дельфин
0 - нет симптомов заболевания
1 - минимальное поражение
2 - выраженное поражение внутренних тканей
3 - поражение внутренних тканей стебля и небольшое поверхностное потемнение
4- сильное поражение тканей стебля, но не по всему диаметру междоузлия
5 - «черная ножка»: поражены все ткани междоузлия, интенсивная черная окраска, стебель высыхает, его верхняя часть выше места инокуляции поникает

Выводы
Введение суицидной плазмиды с фрагментом гена целлюлазы celV в клетки Pectobacterium carotovorum 3-2 привело к инактивации хромосомной копии этого гена.
У клеток клонов P. carotovorum 3-2 с инактивацией гена celV целлюлазная активность использованными методами не детектируется.
Инактивация гена celV не оказывает существенного влияния на способность бактерий P. carotovorum 3-2 инфицировать клубни картофеля.
Инактивация гена celV у бактерий P. carotovorum 3-2 не оказывает существенного влияния на развитие симптомов «черной ножки» при заражении стеблей картофеля.