Хроматография

План лекции:
Адсорбенты и требования к ним.
Влияние адсорбционных характеристик на время удерживания и форму пика.
Преимущества и недостатки адсорбционной хроматографии по сравнению с другими вариантами хроматографического анализа.
Тонкослойная хроматография.
Метод ВЭЖХ и его возможности.
Газоадсорбционная хроматография.
1

Адсорбционная хроматография - метод, основанный на многократном перераспределении молекул определяемого компонента (сорбата) между подвижной фазой (элюентом) и поверхностью твердого сорбента вследствие адсорбции и десорбции этих молекул. Если адсорбционные свойства компонентов смеси различны, то при движении элюента через сорбент компоненты разделяются.
Метод предложен М.С.Цветом (1903)

Требования к адсорбенту
Порошкообразное состояние (размер частиц до 1 мм)
Монодисперсность (например, фракция 10-15 мкм)
Высокая удельная поверхность (свыше 50 м2/г)
Механическая прочность частиц
Химическая инертность
Термостойкость
Наличие активных центров на поверхности

Адсорбенты для жидкостной хроматографии
Неорганические
Органические
целлюлоза и ее производные,
крахмал, тефлон, другие синтетические полимеры
оксид алюминия, силикагель, алюмосиликаты, графит и сажа, мел, тальк и др.
На этих адсорбентах разделяют:
Малополярные органические Неорганические и сильнополярные вещества (углеводороды, их органические вещества (соли, амино- галоидопроизводные, углеводы) кислоты, карбоновые кислоты и др.)
В качестве элюентов при этом используют:
Органические растворители Водные и водно-органические
(гексан, хлороформ и др.) растворы, ацетонитрил и др.
Соответствующие варианты ЖХ называют:
нормально-фазовая обращенно-фазовая
хроматография хроматография

Активные центры
На поверхности адсорбента одновременно существуют разные активные центры, адсорбирующие из ПФ разные частицы.
R
R
R
Предварительная обработка адсорбента (прокаливание, промывка реагентами, радиационная прививка и др.) приводит к доминированию тех или иных центров, то есть к получению адсорбента с заданными свойствами
Силанольные группы (кислотные центры) для нормально-фазовой хроматографии
Алкильные группы (гидрофобные центры для обращенно-фазовой хроматографии)
R = С2, С4, С8, С18, С30

Порядок элюирования
в нормально-фазовой хроматографии
3
2
1
<
<

Порядок элюирования
в обращенно-фазовой хроматографии

Скорости движения компонентов смеси в адсорбционной хроматографии зависят от их коэффициентов адсорбционного распределения (коэффициентов Генри)
С
а
tg α = Г
Г = da / dC = f (C,T)
При низких С Г = Const,
а = Г С
w ≈
При Vнф  Vпф и Г >> 1:
При Г1 = Г2 компоненты выходят из колонки одновременно, не разделяясь

Скорости движения компонентов в адсорбционной хроматографии теоретически не должны зависеть ни от концентрации сорбата, ни от состава пробы.
На практике эти положения иногда не выполняются, особенно при высокой концентрации компонентов
и вводе большой пробы. Это ведет к ошибочным результатам анализа.

Связь изотермы и формы пика

Преимущества и ограничения
адсорбционной хроматографии
Возможность работы при высоких температурах и давлениях;
возможность направленной модификации свойств адсорбента;
селективность адсорбции (вплоть до разделения изотопов и
оптических изомеров);
проявление дополнительного эффекта – разделение молекул
по размерам.
Выбор адсорбентов ограничен, а их свойства при повторном
приготовлении колонки плохо воспроизводимы и теоретически
не предсказуемы;
возможность необратимой сорбции и химических превращений
компонентов пробы на активных центрах;
нелинейность изотерм адсорбции, ведущая к искажению формы
пиков и неполному разделению компонентов.

Основные варианты адсорбционной хроматографии
Классическая жидкостная хроматография (ЖХ)
Тонкослойная жидкостная хроматография (ТСХ)
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, ЖХВД)
Газоадсорбционная хроматография (ГАХ)

Тонкослойная хроматография (ТСХ)
Метод ТСХ предложен в 1938 г. Измайловым и Шрайбер.
Используется для экспрессного полуколичественного и качественного анализа жидкостей (органический синтез, биохимические исследования, криминалистическая экспертиза, контроль качества пищевых продуктов, лекарств и других товаров.

Схема выполнения (А) и результат разделения (Б) двухкомпонентной смеси методом ТСХ
свидетели
проба

Сорбенты для ТСХ:
оксид алюминия, силикагель, мел, целлюлоза, а также композиции этих материалов со связующими (силуфол)
Толщина слоя – не более 1 мм.
Подвижные фазы:
смеси органических растворителей
Нередко сорбент заранее пропитывают растворителем 1, а используют в качестве элюента растворитель 2. Это меняет механизм разделения – молекулы Х распределяются между двумя жидкими фазами (не адсорбционная, а распределительная ТСХ).

Требования к подвижной фазе
Смачивать сорбент, но не взаимодействовать с ним;
Растворять все компоненты пробы (но не одинаково!);
Не затруднять детектирование компонентов;
Легко и количественно удаляться после разделения;
Низкая вязкость, доступность, безвредность.

Проявление хроматограммы в методе ТСХ
Опрыскивание пластины раствором реагента
(дитизон, нингидрин и др.), обработка парами иода.
Спектроскопические методы (УФ, люминесценция).
Радиохимические методы
Объем пробы должен быть минимальным (около 0,01 мл),
чтобы не изменить Rf и правильно опознать компонент.

Индивидуальная характеристика каждого
компонента смеси в методе ТСХ – его подвижность Rf
Линия старта
0 < Rf < 1
Rf = Lx / L0
Линия финиша
Величина Rf зависит
от природы сорбата,
сорбента и элюента,
но от концентрации сорбата и присутствия примесей не зависит.

Метод ТСХ.
Двумерная хроматография смеси красителей
А — ввод пробы;
Б — после обработки первым элюентом;
В — после обработки вторым элюентом.

Измерение сигнала в методе ТСХ
Визуально - по величине и интенсивности пятен;
спектроскопия диффузного отражения;
радиометрические методы;
экстрагируют компонент из пятна и измеряют аналитический сигнал в полученном экстракте
(фотометрия, флуориметрия, кинетические методы и др.)
F -
mx
функция Кубелки-Мунка
F

Прибор для ТСХ

Особенности метода ТСХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, ЖХВД, HPLC)
Метод ВЭЖХ разработан в 1960-х гг. Ш.Хорватом (США) и, независимо от него, Г.Киркландом (Англия).
Используется для качественного и количественного анализа смесей органических веществ в следующих областях:
химическая технология и нефтехимия,
производство лекарственных препаратов,
биохимические исследования и клинический анализ,
криминалистическая экспертиза,
контроль качества пищевых продуктов, лекарств и др.
мониторинг состояния окружающей среды.

1а и 1б - резервуары для разных элюентов,
2 - смеситель для градиентного элюирования,
3 - кран-дозатор,
4 – микроколонка с сорбентом
Принципиальная схема хроматографа для ВЭЖХ
1Б
4
проба
Детектор
1А
2
Насос
3
элюент
Сборник фракций или слив

Колонки для ВЭЖХ
Длина колонки – до 25 см, внутренний диаметр – до 5 мм, внешний – 1-2 см. Материал – сталь + стекло. Некоторые колонки выдерживают давление до 1000 атм.
Набивка – модифицированный силикагель или оксид алюминия, сферические частицы диаметром 5 – 10 мкм.

Основной тип матриц в ВЭЖХ – силикагель
Достоинства
Недостатки
Отработанная технология
синтеза
Доступность и относительно
низкая цена
Большой диапазон свойств
Механическая прочность
Химическая активность
OH-групп на поверхности
pH стабильность (2-9)
Адсорбированная вода

Один из наиболее распространенных и современных жидкостных хроматографов фирмы Shimadzu

Блочный жидкостной хроматограф Agilent 1100

Детекторы для ВЭЖХ

Хроматограмма апельсинового сока
> 50 веществ / < 30 минут / 100 атм

Хроматография при ультравысоких давлениях
Колонка: 43 см х 30 мкм
Сорбент: 1 мкм
Давление: 7100 атм
Максимальная эффективность: 625000 теор.тарелок / метр
Вес установки ~ 7 тонн

Факторы, улучшающие разрешение пиков
в методе ВЭЖХ
Правильный выбор неподвижной фазы;
однородность сорбента, его сферичность;
однородность набивки колонки;
увеличение длины колонки;
уменьшение внутреннего диаметра колонки;
правильный выбор подвижной фазы;
использование градиентного элюирования;
оптимальная скорость потока элюента;
уменьшение объема пробы и массы компонентов.

Неподвижная фаза для
разделения стереоизомеров
Хиральная хроматография
(Разделение стереоизомеров в методе ВЭЖХ)

Разделение оптических изомеров аминокислот
(IBLC)
(NMC)
Column, Mightysil RP-18 (150x4.6 I.D.); mobile phase: methanol-0.01 M Na2HPO4, pH 6.0,
gradient elution flow-rate, 0,5 ml/min. Detection: DAD, =340 nm.
Peaks: 1=L-Asp, 2=D-Asp, 3=L-Glu, 4=D-Glu, 5=L-Asn, 6=D-Asn, 7=L-Ser, 8=L-Gln, 9=D-Ser, 10=D-Gln, 11=D-His, 12=L-Thr, 13=Gly+L-His, 14=D-Thr, 15=D-Arg, 16=L-Arg, 17=-Ala, 18=L-Ala, 19=L-Tyr+GABA, 20=D-Ala, 21=D-Tyr, 22=L-Met+L-Trp, 23=L-Val, 24=L-Phe, 25=D-Met, 26=D-Trp, 27=D-Val, 28=D-Phe,
29=L-Ile, 30=L-Leu, 31=L-Lys, 32=D-Ile, 33=D-Lys, 34=D-Leu.

Газоадсорбционная хроматография (ГАХ)
Метод ГАХ предложен в 1945-1948 гг. Эрикой Кремер (Австрия)
Сейчас в основном используется для быстрого анализа атмосферного воздуха и легких газовых смесей (в химической технологии). Определяют O2, N2, CO2, CO, H2S, SОx, NOx CH4. Тем же методом анализируют высококипящие органические жидкости. В остальных случаях возможности метода ГАХ уступают возможностям ГЖХ. Метод ГАХ реализуют на насадочных (набивных), а также на капиллярных колонках (тонкий слой пористого адсорбента фиксируется на внутренних стенках колонки).