Метод, позволяющий амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК

В начале использования метода
После каждого цикла нагревания-охлаждения
добавляли в реакционную смесь ДНК-полимеразу
небольшая эффективность реакции
требовалось много времени
требовалось много фермента
В качестве ДНК-полимеразы
использовались фрагменты Клёнова
фрагмент Клёнова:
описан в 1970 году
Клёновым и Хеннигсенем
есть 5’ → 3’-полимеразная активность
есть 3’ → 5’-экзонуклеазная активность (корректорная)
нет 5' → 3'-экзонуклеазной активности

В 1969 году Thomas D. Brock and Hudson Freeze описали новый вид термофильных бактерий ─ Thermus aquaticus
(Гейзер бассейна Йеллоустонского национального парка; после были найдены в аналогичных местах обитания по всему миру (природные и антропогенные гидротермы, компостные кучи)
Taxonomic lineage
› Bacteria
› Terrabacteria group
› Deinococcus-Thermus
(одна из самых архаичных фил)
› Deinococci
› Thermales
› Thermaceae
› Thermus

штамм YT-1 ─ первоисточник Taq-полимеразы
грам (─)
прямые палочки разной длины, одиночные или в нитях
диаметр 0,5 – 0,8 мкм
лишены подвижности
хемоорганогетеротрофы
не обладают радиационной
устойчивостью
склонны к агрегации
оптимальная t° – 65 – 70°С
(выживает при 50 - 80°С )

1976 г.: выделена Taq-полимераза,
первый термостабильный фермент, использованный для ПЦР (1988)
используется рекомбинантная форма (производимая E. coli)
скорость синтеза: около 60 нуклеотидов/сек
около 30 циклов
синтезирует гораздо более длинные фрагменты, чем фрагменты Клёнова
Кофакторы : Mg++, Mn++
рН опт. – 8,0
рекомендуемая t°
использования – (68 – 72 °C)
молек. масса: 94 – 95 кДа, 832 а.о.

есть 5′→3′ экзонуклеазная активность
нет 3′→5′ экзонуклеазной активности
ошибки!
Показатели частоты ошибок в ранних исследованиях:
1–2×10−4 [mutation frequency per base pair per duplication]
В более поздних исследованиях: 1.2×10−5 to 8×10−6
Therefore, the fidelity of Taq is better than its reputation

Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архебактерий,
многие обладают коррекционной способностью,
и используются вместо (или в сочетании) с Taq.

Thermus thermophilus
Горячие источники Изу в Японии
Вид выделен в 1971 году и описан в 1974
Таиро Ошимой и Кацутомо Имахори
опт. темп – 68 – 85°C
pH: 3.4 – 9.0
рекомбинантная Tth: активность обратной транскриптазы (Mn2+)