Основные этапы промышленного получения антибиотиков

Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов, обладающие высокой физиологической активностью к определенным группам микроорганизмов и злокачественным опухолям, избирательно задерживая их рост или полностью подавляя развитие.
Специфичность характеризуется: 1. Высокой биологической активностью по отношению к чувствительным микроорганизмам, т.е. даже в очень низких концентрациях проявляют высокий физиологический эффект. Например, пенициллин в концентрации 0,000001 г/мл оказывает выраженное бактерицидное действие. 2. Избирательность действия, например, бензилпенициллин действует только на грамположительные кокки и не оказывает биологического действия на грамотрицательные.

Процесс получения антибиотика включает в себя четыре основные стадии получение соответствующего штамма — продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства; биосинтез антибиотика; выделение и очистка антибиотика; концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.

Первая задача при поиске продуцентов антибиотиков — выделение их из природных источников. Вместе с тем для этих целей широко применяется метод изменения генома выделенного продуцента антибиотика путем мутагенеза и генной инженерии.
В основу большинства приемов выделения продуцентов положен принцип выделения чистой культуры микроба и непосредственного испытания его по отношению к используемым тест-организмам.
Большинство сапрофитных бактерий хорошо развивается на богатых по составу натуральных средах (мясопептонный агар, картофельный агар, сусло-агар и др.) при рН около 7,0 и температуре 30–37 °С. В этих же условиях развиваются актиномицеты и некоторые грибы, но для них они менее благоприятны, чем для бактерий.
Актиномицеты растут медленнее, чем бактерии; они могут использовать такие источники питания, которые не очень хорошо усваиваются бактериями. Для выделения актиномицетов рекомендуются среды, приведенные в табл. 15.7.112. Значение рН среды после стерилизации устанавливается в пределах 6,8–7,1.
Мицелиальные грибы предпочтительнее развиваются на средах с несколько пониженным значением рН (4,5–5,0), на которых плохо растут многие бактерии и актиномицеты. Для выделения мицелиальных грибов можно рекомендовать среды

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, относятся состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные условия, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа микроорганизмов и другие факторы.
Среды для культивирования микроорганизмов. Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д.), содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:
мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике;
картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;
среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция, фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким выходом антибиотиков.
Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально. Синтетические среды могут быть как относительно простыми, так и сложными, для составления которых используют методы математического планирования эксперимента.
Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений

При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы. Однако не все продуценты обладают достаточно активными амилазами, способными осуществлять гидролиз крахмалсодержащего сырья. Предварительное осахаривание крахмалсодержащих материалов с помощью ферментов значительно облегчает использование микроорганизмами этих материалов.
Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной (реже азотистой) кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза. Многие микроорганизмы успешно используют и окисленные формы азота, некоторые из них нуждаются именно в нитратном источнике азота (Streptomyces auranticus, S. subtropicus и некоторые другие). Ряд актиномицетов иногда усваивают лучше нитраты, чем аммонийные соли; они могут использовать даже нитриты, если их вносят в среду в небольших количествах (не более 50 мг NaNO2 / 1 л среды). При этом усвоение нитритов тесно связано с источником углерода; например в присутствии глицерина нитриты потребляются гораздо лучше, чем в присутствии глюкозы. Использование аммония и некоторых органических источников азота плесневыми грибами улучшается в присутствии небольших количеств (0,1–0,2 %) некоторых дикарбоновых (янтарной и фумаровой) кислот. В ряде случаев для накопления антибиотика необходимо присутствие и аммонийного, и нитратного источника азота (биосинтез пенициллина).
Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C : N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.

Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы.
Большинство микроорганизмов легко используют в качестве источников фосфора ортофосфаты. Отдельные виды наряду с этим потребляют и фитаты (соли инозитфосфорных кислот).
Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде можно разделить на три группы:
высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % (продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина);
продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,010–0,015 % (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина);
малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,018–0,020 % (продуценты новобиоцина, грамицидина, олеандомицина).
Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами (пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин и др.), бактериями (бацитрацины, субтилины, низины) и актиномицетами (эхиномицины, группа тиострептона). Обычно источником серы в среде служат сульфаты. Однако при биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента служит тиосульфат натрия.
Кроме того, для биосинтеза антибиотиков необходимы и отдельные микроэлементы. Так, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при значительной концентрации железа в среде. Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков.
Биосинтезу ряда антибиотических веществ (хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др.) способствуют ионы цинка.
Стимулирующее влияние на биосинтез гентамицина, курамицина А, фософономицина оказывают ионы кобальта.
Ионы галогенов входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола.

Влияние рН среды. Многие бактериальные организмы, синтезирующие антибиотики, лучше развиваются при рН около 7,0, хотя некоторые, например молочнокислые стрептококки, продуцирующие низин, лучше развиваются в среде при рН = 5,5÷6,0.
Большинство актиномицетов хорошо развиваются при начальных значениях рН среды в пределах от 6,7 до 7,8; в большинстве случаев жизнеспособность актиномицетов при рН ниже 4,0–4,5 подавлена.
Температура. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30–37 °С. Для продуцента грамицидина С (B. brevis) оптимальная температура для развития и биосинтеза равна 40 °С.
Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26–30 °С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных (от 0 до 18 °С), так и при повышенных (55–60 °С) температурах.
Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура составляет 25–28 °С.
Аэрация. Большинство изученных продуцентов антибиотиков являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и др.) максимальное их накопление происходит при степени аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за 1 мин продувается такой же объем воздуха.
В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от стадии развития, вязкости КЖ и других факторов. На определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя добавлением пероксида водорода.