Оценка качества прочтений NGS

Примеры экспериментов в основе которых лежит NGS
Этап обработки данных
Формат данных
Ресеквенирование человеческих генов
RNA - seq
Формат данных
Этап обработки данных
Сырые риды (FASTQ)
Выравненные риды (SAM/BAM)
Сырой набор вариантов (VCF)
Аннотированные варианты (VCF)
Выравнивание
Определение вариантов
аннотация
Интерпретация отличий от референса / диагноз
Сырые риды (FASTQ)
Выравненные риды (SAM/BAM)
Уровни экспрессии FPKM (TCV)
Список дифф. экспрес. генов
Выравнивание
Подсчет количества ридов, выравненных в конкретное место
Анализ диф. экспресии
Интерпретация DEG / изменение в сигнальных и метаболических путях

Сырые данные на выходе у секвенатора
Этап обработки данных
Формат данных
Ресеквенирование человеческих генов
RNA - seq
Формат данных
Этап обработки данных
Сырые риды (FASTQ)
Сырой набор вариантов (VCF)
Аннотированные варианты (VCF)
Выравнивание
Определение вариантов
аннотация
Интерпретация отличий от референса / диагноз
Сырые риды (FASTQ)
Выравненные риды (SAM/BAM)
Уровни экспрессии FPKM (TCV)
Список дифф. экспрес. генов
Выравнивание
Подсчет количества ридов, выравненных в конкретное место
Анализ диф. экспресии
Интерпретация DEG / изменение в сигнальных и метаболических путях
Выравненные риды (SAM/BAM)

Контроль качества обязательный этап
Этап обработки данных
Формат данных
Ресеквенирование человеческих генов
RNA - seq
Формат данных
Этап обработки данных
Сырые риды (FASTQ)
Сырой набор вариантов (VCF)
Аннотированные варианты (VCF)
Выравнивание
Определение вариантов
аннотация
Интерпретация отличий от референса / диагноз
Сырые риды (FASTQ)
Выравненные риды (SAM/BAM)
Уровни экспрессии FPKM (TCV)
Список дифф. экспрес. генов
Выравнивание
Подсчет количества ридов, выравненных в конкретное место
Анализ диф. экспресии
Интерпретация DEG / изменение в сигнальных и метаболических путях
Выравненные риды (SAM/BAM)
Контроль качества
Контроль качества

А на кой черт оно собственно надо?

А на кой черт оно собственно надо?
Сырые данные, полученные в ходе работы секвенатора. Их вы подает на вход вашего pipeline. Часто вы начинаете с FASTQ файлов.

А на кой черт оно собственно надо?
Сырые данные, полученные в ходе работы секвенатора. Их вы подает на вход вашего pipeline. Часто вы начинаете с FASTQ файлов.
Ваш pipeline – последовательность инструментов, которыми вы обрабатываете данные

А на кой черт оно собственно надо?
Сырые данные, полученные в ходе работы секвенатора. Их вы подает на вход вашего pipeline. Часто вы начинаете с FASTQ файлов.
Ваш pipeline – последовательность инструментов, которыми вы обрабатываете данные
Результат анализа

А на кой черт оно собственно надо?
Сырые данные, полученные в ходе работы секвенатора. Их вы подает на вход вашего pipeline. Часто вы начинаете с FASTQ файлов.
Ваш pipeline – последовательность инструментов, которыми вы обрабатываете данные
Результат анализа
Основное правило: GIGO -
garbage in, garbage out

А на кой черт оно собственно надо?
Сырые данные, полученные в ходе работы секвенатора. Их вы подает на вход вашего pipeline. Часто вы начинаете с FASTQ файлов.
Ваш pipeline – последовательность инструментов, которыми вы обрабатываете данные
Результат анализа
Основной вывод: обязателен контроль качества входных данных

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591
Идентификатор последовательности с необязательным описанием. Начинается с символа @

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591
Идентификатор последовательности с необязательным описанием. Начинается с символа @
Последовательность “прочтенных” нуклеотидов

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591
Идентификатор последовательности с необязательным описанием. Начинается с символа @
Последовательность “прочтенных” нуклеотидов
Служебная строка

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591
Идентификатор последовательности с необязательным описанием. Начинается с символа @
Последовательность “прочтенных” нуклеотидов
Служебная строка
Строка, содержащая значения качества (Q score) для нуклеотидов из второй строки.

FASTQ формат
@cluster_2:UMI_ATTCCG
TTTCCGGGGCACATAATCTTCAGCCGGGCGC
+
9C;=;=<9@4868>9:67AA<9>65<=>591
Идентификатор последовательности с необязательным описанием. Начинается с символа @
Последовательность “прочтенных” нуклеотидов
Служебная строка
Строка, содержащая значения качества (Q score) для нуклеотидов из второй строки.
Q score – показатель, зависящий от вероятности неправильного прочтения данного нуклеотида. Существует несколько вариантов определения Q score в зависимости от платформы, на которой осуществлялось секвенирование.
Qsanger = -10log10(p) Qsolexa = -10log10(p/(1-p))
Где p – вероятность, что соответствующий нуклеотид определен неверно.

Q score кодируется символами ASKII

FastQC
FastQC – инструмент, позволяющий проводить контроль качества сырых ридов.
В настоящее время по сути стал стандартом для этой цели

Quality score по основаниям в ридах
Красная линия – медианное значе ние Qscore в данной позиции рида
Синяя линия – среднее значение
График ящик с усами: желтый прямоугольник – межквартильное расстояние
«Усы» - ограничивают часть выборки между 10% и 90% значений

Ухудшение качества прочтения к концу ридов

Quality score целых последовательностей
Этот график позволяет увидеть часть ваших последовательностей, имеющих более низкое среднее качество, чем большинство ридов. Их должно быть не много

Содержание нуклеотидов по позициям в ридах
График показывает пропорцию по нуклеотидам в конкретной позиции ридов. В полностью рандомизированной библиотеке вы ожидаете увидеть незначительные отличия по содержанию конкретного нуклеотида в зависимости от позиции. В общем случае оно должно быть примерно равно доле этого нуклеотида во всей ДНК данного организма.

Содержание нуклеотидов по позициям в ридах
График показывает пропорцию по нуклеотидам в конкретной позиции ридов. В полностью случайной библиотеке вы ожидаете увидеть незначительные отличия по содержанию конкретного нуклеотида в зависимости от позиции. В общем случае оно должно быть примерно равно доле этого нуклеотида во всей ДНК данного организма.

Содержание GC по позициям в ридах
В случаной библиотеке вы ожидает увидеть незначительную разницу по содержанию GC в зависимости от позиции. Общее содержание GC должно отражать содержание GC в геноме исследуемого организма. Пики на графике могут отражать наличие в вашей библиотеке чрезмерной представленности определенной последовательности.

Содержание GC в целых последовательностях
Вы ожидаете увидеть похожее на нормальное распределение с одним пиком. Наличие второго пика может указывать на загрязнение библиотеки ДНК второго организма.

Содержание N по позиции в ридах
Наличие небольшого количество N (неопределенных нуклеотидов) в ридах, полученных секвенатором достаточно распространенное явление. FastQC выдает предупреждение, если содержание N больше 5%. Если содержание N более 20% эксперимент считается неудачным.

Распределение длин прочтений

Распределение длин прочтений

Дуплицированные последовательности
В полностью рандомизированной библиотеке большинство сиквенсов встречаются в ридах только 1 раз. Небольшой количество дупликаций может свидетельствовать об очень высоком покрытии таргетного сиквенса. Очень большой уровень дуплекации скорее всего связан с обогащением библиотеки определенным сиквенсом .

Сверхпредставленные последовательности
Обычно библиотека для NGS содержит разнообразный набор последовательностей, без единственной последовательности, составляющая существенную часть всего набора. Обнаружение существенно перепредставленной последовательности может означать, что такая последовательность высоко биологически значима или что при подготовке библиотеки произошла контаминация.
В этом модуле представляются все последовательности, составляющие более 0,1% от общего количества.
Для каждой такой последовательности программа произведет поиск совпадений с распространенными контаминирующими агентами и выведет лучшие сопадения. Совпадений не обязательно указывают на конкретный источник контаминации, но может указать правильное направление.
Стоит помнить, что последовательности адаптеров очень похож.

Сверхпредставленные последовательности

Содержание адаптеров