Paramyxoviridae

FAMILIILE ORTHO- ŞI PARAMYXOVIRIDAE
Mixovirusurile reunesc virusuri ARN- cu afinitate pentru mucoproteine (myxo – mucus) repartizate în 2 familii:
Orthomyxoviridae
Paramyxoviridae

FAMILIA ORTHOMYXOVIRIDAE
Genuri: Alphainfluenzavirus (virusul gripal tipul A)
Betainfluenzavirus (virusul gripal tipul B) Gammainfluenzavirus (virusul gripal tipul C)
Deltainfluenzavirus (virusul gripal tipul D, virusul gripei bovine, izolat 2011, clasificat in 2016)
Isavirus
Thogotovirus (virusurile Dhori şi Thogoto)
Quaranjavirus
Influenzavirus - agenţii cauzali ai gripei – infecţie respiratorie acută cu simptome sistemice importante.
1933 – prima cultură de virus gripal uman (Smith, Andrewes şi Laidlaw).

Virusul gripal A se întâlneşte la om şi animale: porc, cal, păsări, foci, balene, etc.
Virusul gripal B – om (foci, cai, câini, porci)
Virusul gripal C – om (câini, porci, bovine, camile)
Virusul gripal D – rezervor - porci, bovine; izolat de la om, camile, cai, capre, oi)
Tipul A provoacă pandemii periodice (1918 – 20-100 mln decese, 1957, 1968, 1977, 2009)
Tipurile A şi B – epidemii regionale şi locale. Anual – 3-5 mln cazuri grave, 300 – 650 mii decese.

MORFOLOGIA, COMPOZIŢIA CHIMICĂ A
VIRUSULUI GRIPAL tipul A
Particule rotunde, 80-120 nm, sau pleomorfe, constituite din:
Genom
Compus din 8 segmente de ARN-, care codifică 11 proteine (HA, NA, NP, PA, PB1, PB1-F2, PB2, M1, M2, NS1, NS2 (NEP)

HA – hemaglutinina
NA - neuraminidaza
NP - nucleoproteina
PA, PB1, PB2 – polimeraze
PB1-F2 – inhibă inducerea producerii de interferon tip I
M1 – proteină matrix
M2 – proteină membranară
NS1, NS2 – proteine nestructurale

Capsida (NC) – tubulară, de simetrie helicoidală, separată pentru fiecare segment.
Supercapsida
Derivă din MCP a celulei-gazdă
Dublu strat lipidic extern (origine celulară)
Strat intern proteic (proteine virale M1, M2) – M1 asigură legătura dintre GP de suprafaţă şi NC; M2 - canal ionic
2 tipuri de GP înserate în membrană: hemaglutinina - HA (H) şi neuraminidaza -NA (N), distincte morfologic şi biologic.

Hemaglutinina (HA, H) H1 – H18
Trimer compus din 2 polipeptide HA1 şi HA2
HA1 – fixarea specifică a virionilor la receptori glicopeptidici membranari (inclusiv de pe hematii, determinând hemaglutinarea), ce conţin acid N-acetilneuraminic/acid sialic
HA2 – fuziunea supercapsidei cu membrana celulei-gazdă
Anticorpii anti-HA:
Inhibă fixarea virusului pe celula-ţintă
Inhibă hemaglutinarea

Neuraminidaza (NA, N) N1 – N11
Tetramer, polipeptid unic. Clivează legătura dintre acidul sialic şi glucidul alăturat .
Funcţii :
Promovează accesul la celulele țintă prin degradarea mucusului
Ajută în prevenirea superinfecției celulelor deja infectate (tratarea celulelor cu neuraminidază impiedică infecţia celulei cu virus)
Poate inactiva receptorii mucoproteici solubili din secrețiile respiratorii
Asigură detaşarea virionilor înmuguriţi prin eliminarea acidului sialic din receptorii celulari
Anticorpii anti-NA limitează diseminarea virionilor

Se cunosc 18 varietăţi de HA (H1-H18) şi 11 de NA (N1-N11), asociaţiile lor formează subtipuri de virus A.
16 subtipuri de HA și 9 subtipuri de NA au fost identificate la păsări acvatice
H1, H3 și N1, N2 – la porci
H3, H7 și N7, N8 – la cai
H17N10 si H18N11 - identificate recent la lilieci
La om – H1, H2, H3 şi N1, N2 (H1N1; H2N2; H3N2)

Descrierea unei tulpini de virus gripal:

STRUCTURA ANTIGENICĂ a virusului gripal A
Ag interne NP şi M, specifice de tip (A,B,C)
Ag externe HA şi NA, specifice de subtip şi de variantă

VARIAŢII ANTIGENICE ALE VIRUSURILOR GRIPALE TIPUL A
Variaţii Ag minore – drift (mutaţii punctiforme, modifică câţiva AA din HA, NA sau alte proteine virale) cu aparitia unor tulpini/varietăţi de subtipuri. Mutațiile sunt cauzate de ARN-polimeraza virală (nu are capacitate de corecție). Provoacă epidemii fiecare 3-4 ani, caracteristic pentru tipurile A şi B
Variaţii Ag majore – shift (recombinaţii genetice, schimbarea completă a unui sau câtorva segmente genomice –HA, NA, P, M, etc). Determina modificări importante, aparitia subtipurilor noi, caracteristic pentru tipul A.

Dacă o tulpină animală se reasortează cu o tulpină umană, atunci poate apărea o tulpină nouă care este capabilă de transmitere de la om la om - acest lucru a provoacă pandemii.
Porcii, liliecii și prepelițele au receptori atât pentru virusul gripal tipul A de mamifere, cât și de păsări, deci sunt potențiale gazde pentru reasortare.

Cultivarea virusului gripal
Ou embrionat de găină (cavitatea amniotică şi alantoică)
Culturi de celule (fibroblaşti de pui, culturi primare de rinichi de maimuţă, linii celulare de rinichi de câine MDCK, linii Vero)
Reproducerea infecţiei la maimuţe, dihori

REPLICAREA
Tropism – epiteliul nazal, traheo-bronhial, plamâni la mamifere, intestinele la pasari.
Inițial neuraminidaza descompune mucusul, facilitând accesul virusului la celulele epiteliale.

Etapele replicării:
ATAŞAREA (adsorbţia) – HA1+receptorul din acid sialic
PENETRAREA – dupa ce o protează clivează HA, virionul pătrunde în celulă prin endocitoză
DECAPSIDAREA – prin fuziunea supercapsidei şi a membranei vacuolei de endocitoză (HA2) și disocierea NC (M2 determină formarea unui canal ionic, protonii care pătrund provoacă acidifierea mediului și descompunerea NC în ARNv și proteine), cu penetrarea ARN și a ARN-polimerazei în nucleu prin porii membranei nucleare.

BIOSINTEZA (eclipsa)
Transcrierea ARNm (transcriptaze PA, PB1, PB2) - nucleu
Replicarea genomului: ARNv..ARNc..ARNv - nucleu
Translaţia ARNm şi sinteza proteinelor virale - citoplasmă

ASAMBLAREA
În citoplasmă: HA şi NA (via aparatul Golgi)
se inseră în MCP, iar M1 şi M2 o căptuşesc din interior
În nucleu: NP se asociază cu segmentele de ARN-, formând NC, care apoi migrează spre zonele modificate ale MCP
ELIBERAREA: prin înmugurire
NA ajută la desprinderea virionilor de MCP şi evită formarea agregatelor. Celula rămâne aparent viabilă, dar epuizată şi moare.
Citoliza este determinată de răspunsul imun citotoxic (NK, LTc).

PATOGENEZA GRIPEI
Sursa de infecţie – omul bolnav (rareori animale, păsări).
Cazuri sporadice de gripă aviară (H7N1, H9N2, H5N1, H7N9) la om – 1997 în Hong Kong, 2003/04 în Vietnam, 2013 China;
gripă porcină (N1N1) – 2009-2010
Barierele moleculare (receptori diferiți) limitează transmiterea interumană a virusurilor aviare sau porcine.

Receptorul de virus gripal uman, SA α 2,6 galactoză, este dominant pe celulele epiteliale ale mucoasei nazale, sinusurilor paranazale, faringelui, traheii și bronhilor.
Receptorul de virus gripal aviar, SA α 2,3 galactoză, se găsește în principal pe celulele bronhiolare neciliate la jonctiunea între bronhiole și alveole.

Mecanisme de transmitere
aerogen, prin picături Pflugge (tuse, strănut)
prin contact direct cu lichidele biologice infectate (secreții nazale, salivă, spută, sânge, masele fecale ale păsărilor bolnave)
contact indirect cu suprafețele contaminate – bancnote, mânere, intrerupătoare, etc (cu atingerea ulterioară a mucoasei nazale, a cavității bucale, a conjunctivei).
Cantitatea virusului este maximă în rinofaringe în primele 2 zile de la debutul bolii, dar poate persista până la 9 zile.
Contingente de risc - copii, persoane în vârstă, cu imunosupresie, bolnavi cu maladii cronice cardiovasculare, respiratorii, insuficienţă renală, diabet.

Virusurile gripale au o predilecție pentru tractul respirator din cauza prezenței receptorilor lor. Ele se înmulțesc în celulele epiteliale respiratorii ciliate, ducând la anomalii ciliare funcționale și structurale, iar viremia este rar detectată.
Aceste procese sunt însoțite de stoparea sintezei proteinelor și a acidului nucleic în celulele afectate, eliberarea enzimelor lizozomale hidrolitice și descuamarea atât a celulelor epiteliale ciliate cât și a celor producătoare de mucus (interferență cu mecanismul de eliberare mecanică a tractului respirator).

Procesul de moarte celulară programată (apoptoza) are ca rezultat activarea componentelor complementului, conducând la inflamații localizate cu edem. La începutul infecției, stimulul chemotactic primar este îndreptat spre limfocite, care constituie componenta inflamatorie celulară majoră.
Aceste afecțiuni fac gazda foarte susceptibilă la superinfecția bacteriană invazivă.
Restabilirea epiteliului respirator durează de la 2 până la 10 săptămâni.

Forme clinice
Gripa inaparentă, asimptomatică (33%)
Gripa comună (benignă, durata 4-7 zile). Incubaţia câteva ore - 2 zile. Debut brutal, cu frison, febră, cefalee, rinoree, tuse, mialgii, artralgii, anorexie, astenie (IFN?). Complicaţii (infecţii secundare bacteriene): otită, sinusită, bronşită, bronhopneumonie, etc. Complicaţii rare: sindromul Reye (encefalită acută cu degenerescenţa ficatului); sindromul Guillain-Barre (poliradiculonevrită)
Gripa malignă (pneumonie virală primitivă cu edem pulmonar şi insuficiență respiratorie acută)

Circulația globală a virusurilor gripale, OMS

Regiunea Europeană a OMS

Republica Moldova

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL GRIPEI
Prelevate: lavaje/aspiraţii nazale, traheale, expectoraţii bronhice (în primele 48 ore)
Examenul virusoscopic –RIF, microscopia electronica
Examenul virusologic
- Izolarea în oul embrionat de găină de 10-11 zile sau culturi de celule (MDCK).
- Indicarea virusului – activitate hemaglutinantă faţă de eritrocite de cobai, găină, curcan a lichidului amniotic şi alantoic, hemadsorbţia lor pe cultura de celule. - Identificarea – RIF, RIHA, RIHAds, RN
Detectarea Ag virale în sedimentul celular (RIF, ELISA)
Detectarea genomului viral (PCR)

5. Serodiagnosticul gripei
Retrospectiv, de confirmare. Se examinează seruri perechi. Se determină creşterea titrului de Ac de 4 ori, sau prezenţa Ac Ig M.
Reacţii:
RFC cu Ag NP (determinarea tipului)
RIHA cu tulpina virală circulantă
ELISA
RN
Imunitatea: celulară (LTc, NK), umorală (IgG, sIgA), specifică de subtip.

TRATAMENTUL GRIPEI
Amantadină, rimantadină. Împiedică pătrunderea NC în citoplasma celulei infectate cu virus A (blocheaza canalul ionic). Tulpini rezistente au fost izolate.
Zanamivir, oseltamivir. Au structura similară acidului neuraminic. Inhibă activitatea NA, împiedicând eliberarea virusurilor A şi B şi diseminarea lor prin mucus, determină agregarea virionilor.
Arbidol (inhibă fuziunea supercapsidei cu membrana celulară).
Interferon (viferon, grippferon)
Tratament simptomatic (antipiretice, antibiotice…)

PROFILAXIA SPECIFICĂ A GRIPEI
Vaccinuri inactivate: conţin 2 tulpini de virus A (H1N1 şi H3N2) şi o tulpină B (sau 2 tulpini B), cultivate in ovo şi inactivate cu beta-propiolacton. Inoculare i/m, s/c; Ig G persistă 5-6 luni.
Vaccinuri vii atenuate. Tulpinile sunt cultivate in ovo la 25 C, atenuate prin pasaje multiple. Administrare intranazală prin aerozol, imunitate locală (sIg A).
Vaccinuri subunitare, constituite din HA virale
În curs de cercetare – vaccinuri vii/subunitare recombinante, vaccinuri polinucleotidice.

Oamenii de stiinta de la British Medical Research Council (MRC), în colaborare cu colegii din Elvetia au descoperit ca anticorpul FI6 a fost eficace in prevenirea si tratarea gripei la soareci si dihori (studiu publicat în Science Express).
Este prima dată când un singur anticorp a fost găsit eficient împotriva tuturor tulpinilor de gripă A, cel mai frecvent tip care este responsabil pentru pandemiile globale.

Researchers determined the crystal structure of the FI6 antibody when it was bound to H1 and H3 HA proteins. Sitting atop the HA spike is a globular head domain that binds to cellular receptors during viral entry and contains the major antigenic sites targeted by the immune system. Because of this selective pressure, the sequence in the head domain drifts enough to require an updated seasonal vaccine most years. A stalk domain connects the head to the viral membrane and is responsible for fusing viral and host membranes so that the pathogen can invade human cells. The immune system usually does not have a strong response to the partially hidden stalk domain, so portions of the stalk remain highly conserved across all influenza subtypes. The FI6 antibody makes extensive contacts with conserved parts of the stalk, thereby blocking HA from harpooning a sticky fusion peptide into the host membrane during viral entry.

Infecţia cu virusul gripal nou A(H1N1)
La inceputul anului 2010 OMS raportează 17.000 de decese din cauza gripei de tip nou A(H1N1).
Evenimentele derulate prin apariţia bruscă, răspândirea rapidă şi transmiterea de la om la om a gripei noi A(H1N1), au impus OMS să ridice faza pandemică la nivelul 6.

Épidémie de grippe A (H1N1) de 2009. Noir : morts confirmées. Rouge : infections confirmées. Orange : cas suspects.

S-a stabilit că virusul gripal nou A(H1N1) conţine gene ale virusului gripal de origine porcină (tulpini americane şi euro-asiatice), gene de origine aviară şi umană. Oamenii de ştiinţă l-au mai numit „reasortant cvadruplu”. Sub aspect antigenic virusul gripal de tip nou A(H1N1) mult diferă de acel gripal sezonier uman A(H1N1), de aceea vaccinurile antigripale umane sezoniere nu pot acorda protecţie contra gripei de tip nou A(H1N1).

Epidemiologie
Virusul nou A(H1N1) se transmite de la om la om prin aceleaşi mecanisme ca şi virusurile gripale sezoniere. Ele în mod obişnuit se transmit de la om la om prin tuse şi strănut de la persoanele bolnave cu gripă. Uneori oamenii se pot îmbolnăvi indirect prin atingerea suprafeţelor, obiectelor infectate cu virusuri gripale şi ulterior atingând mucoasele oculare, bucale şi nazale.
Oamenii pot fi contagioşi cu o zi înaintea apariţiei simptomelor gripale şi 7 zile de la debutul maladiei. Copiii, în special cei mici, pot fi contagioşi mai multe zile.

Particularităţile tabloului clinic.
Gripa cu virusul nou A(H1N1), spre deosibire de cea sezonieră, se manifestă clinic preponderent la persoane tinere, anterior sănătoase. Manifestările clinice sunt asemănătoare cu cele din gripa sezonieră. Pacienţii prezintă semne clinice caracteristice, ce includ cel puţin două din următoarele simptome: febră, tuse, dureri în faringe, mialgii generale, cefalee (mai des frontală), frisoane, posibil diaree şi vomă. Frecvenţa atestării sindromului dispeptic (11-38%) este mai mare decât în gripa sezonieră. Durata bolii în majoritatea cazurilor este de 4-6 zile, cu o maximă de 13 zile. Este posibilă dezvoltarea pneumoniilor, care pot evolua cu sfârşit letal.

FAMILIA PARAMYXOVIRIDAE
FAMILIA PARAMYXOVIRIDAE
SUBFAMILII :
PARAMYXOVIRINAE (genurile Paramyxovirus, Rubulavirus, Morbillivirus)
PNEUMOVIRINAE (genurile Pneumovirus, Metapneumovirus)

CARACTERISTICA GENERALĂ A PARAMYXOVIRUSURILOR
Virusuri învelite, sferice, uneori filamentoase, 150-400 nm.
Genomul – ARN- nesegmentat (transcriptaza asociată)
Capsida – de simetrie helicoidală, constituită din proteina NP. În asociaţie cu ARN formează NC tubulară de 18 nm diametru
Supercapsida – dublu strat lipidic, proteina internă matrice M, spiculi glicoproteici înseraţi în membrană:
HN – asigură adeziunea la celula-ţintă
F – asigură fuziunea supercapsidei cu membrana celulară în timpul penetrării virusului în celulă (provoacă formarea de sinciţii în culturi de celule)
Reproducerea are loc în citoplasmă