Полимеразная цепная реакция. Polymerase Chain Reaction

История метода
В 1971 г. норвежский учёный Хьелль Клеппе предложил способ амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров.
ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком
Кери Муллисом.

История метода
Science. 1985. V. 230. P. 1350-1354
Нобелевская премия
1993

Использование ПЦР

Применение ПЦР
Клонирование генов
Генотипирование организмов
Диагностика наследственных, инфекционных и онкологических заболеваний
Идентификация личности и установление родства; криминалистика
Анализ древних останков, эволюционная биология
Детекция ГМО

Основные этапы ПЦР
ДЕНАТУРАЦИЯ
ОТЖИГ ПРАЙМЕРА
ЭЛОНГАЦИЯ

1) Денатурация ДНК
95°С

2) Отжиг (гибридизация) праймеров
Температура отжига зависит от длины и состава праймеров (50 – 70°С)

3) Элонгация
72°С
Дезоксирибонуклеозидтрифосфоты
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

Увеличение ампликона происходит в геометрической прогрессии

ДНК-полимеразы, используемые при проведении ПЦР
Termus aquaticus – бактерия, живущая в горячих источниках Йеллоустонского национального парка США при температуре, близкой 85 °С

ДНК-полимеразы, используемые при проведении ПЦР

Подбор праймеров
Длина праймеров – 18-30 нуклеотидов
Содержание GC должно составлять 45-55%
Разница в температурах отжига между прямым и обратным праймером не более 5оС
Не должны формировать димеры на 3-концах
Не должны формировать шпилек на 3-конце

Основные компоненты для проведения ПЦР
ДНК-матрица
ДНК-полимераза
Буфер:
- 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; - 50 mM KCl;
- 1,5-2.5 mM MgCl2
Праймеры
dNTP

Дополнительные компоненты для проведения ПЦР
ДМСО (5%) – улучшает амплификацию GC-богатых матриц и отжиг праймеров
Формамид (1-5%) – улучшение специфичности реакции
Глицерин (1-10%), БСА (0,01-0,1%), Triton X100 (0.05-0.1) – стабилизаторы фермента
(NH4)2SO4 (1-10%) – улучшение отжига праймеров

Ингибиторы ПЦР

95˚C- 2 мин (горячий старт - денатурация)
2) 94˚С -30 сек (денатурация)
3) 62˚С -45 сек (отжиг) 25-40циклов
4) 72˚С -40 сек (элонгация)
72˚С -3-5 мин (конечная элонгация)
Программа для проведения ПЦР