Мононуклеарные клетки пуповинной крови, экспрессирующие фактор роста нервов,для коррекции патологии в модели болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера – прогрессирующее неизлечимое
нейродегенеративное заболевание, главным проявлением
которого является деменция. Перспективным направлением в разработке методов лечения болезни являются генно-клеточные технологии.
Фактор роста нервов (NGF) — белок семейства нейротрофинов, поддерживающий жизнеспособность нейронов и стимулирующий их развитие и активность.
Одним из наиболее перспективных подходов к лечению болезни Альцгеймера является применение мононуклеарных клеток пуповинной крови, экспрессирующих различные нейротрофические факторы.
Введение

Целью данной работы явилась оценка терапевтического потенциала МКПК, трансдуцированных аденовирусами, экспрессирующими фактор роста нервов (NGF) на модели болезни Альцгеймера (APP/PS1 трансгенные мыши (Alz)).
Цели и задачи
В связи с целью были поставлены следующие задачи:
1. Трансплантировать МКПК человека, экспрессирующие NGF мышам с болезнью Альцгеймера.
2. Изучить иммуногистохимическим методом влияние NGF-экспрессирующих МКПК на характер и интенсивность экспрессии нестина и даблкортина в гиппокампе трансгенных мышей на сроках 7 суток, 48 суток и 3 месяца.
3. Оценить выживаемость трансплантируемых клеток и их способность к хоумингу и экспрессии в ткани мозга терапевтического гена.

Было сформировано 4 экспериментальных группы:
WT (дикий тип, контроль)
Alz-EGFP (трансгенные мыши после трансплантации МКПК, экспрессирующих репортерный белок EGFP)
Alz-NGF (трансгенные мыши после трансплантации МКПК, экспрессирующих NGF)
Alz (трансгенные мыши, контроль).
Инъекция МКПК осуществлялась ретроорбитально. Забор материала (головной мозг) у мышей осуществлялся на 7-е и 48-е сутки после трансплантации.
В исследовании были использованы трансгенные мыши генотипа APP/PS1, экспрессирующие химерный человеческий/мышиный белок предшественник бета-амилоида и мутантный человеческий пресенелин-1. Обе мутации связаны с развитием ранних форм болезни Альцгеймера и вызывают отложения бета-амилоидного пептида в головном мозге мышей, а также связаны с нарушениями пространственной памяти.
Модель эксперимента

Методика иммуногистохимического окрашивания:
День 1
День 2
Промывка в PBST (4 раза по 5 мин)
Инкубация в PBST-DS
Инкубация в первичных антителах
Промывка в PBS (4 раза по 5 мин)
Инкубация во вторичных антителах
Промывка в PBS (4 раза по 5 мин)
Инкубация в DAPI
Промывка в PBS (4 раза по 5 мин)
Заключение под покровное стекло
Использованные первичные антитела:
Исследование хоуминга клеток в головном мозге: антитела к человеческому антигену (Hnu) и белку фактора роста нервов (NGF)
Исследование нейрогенеза после трансплантации клеток: первичные антитела к нестину и даблкортину

Хоуминг NGF-позитивных клеток в коре и гиппокампе головного
мозга
Визуализация трансплантированных клеток в мозге трансгенных мышей APP/PS1. Окрашивание срезов коры (ctx) и гиппокампа (hipp) трансгенных мышей APP/PS1 после трансплантации NGF-экспрессирующих МКПК (группа Alz-NGF) с антителами к HNu (желтый) и NGF (красный) на сроке 7 суток (слева) и 48 суток (справа). Ядра окрашиваются DAPI (синим). Шкала представляет значение 10 мкм.

Оценка нейрогенеза
Для оценки процессов нейрогенеза исследовали характер и интенсивность экспрессии маркеров нейрональных стволовых и прогениторных клеток (нестин, даблкортин) в гиппокампе.
Нестин - белок промежуточных филаментов, маркер прогениторных клеток, находящихся на стадии пролиферации.
Даблкортин (DCX) – ассоциированный с микротрубочками белок, экспрессирующийся в мигрирующих и дифференцирующихся нейронах
DCX
Nest
Иммуноэкспресссия даблкортина (красный цвет) и нестина (желтый цвет), зубчатая извилина Alz-NGF мыши. Срок трансплантации клеток – 7 суток.
Измерения производились в программе ImageJ. Интенсивность свечения вторичных антител оценивалась через показатель mean gray value - сумма серых значений всех пикселей в выделенном сегменте, деленная на количество пикселей.

Экспрессия даблкортина в гиппокампе после трансплантации МКПК, экспрессирующих NGF
Зубчатая извилина
Зона CA1
Зона CA3

Экспрессия нестина в гиппокампе после трансплантации МКПК, экспрессирующих NGF
Зубчатая извилина
Зона CA1
Зона CA3

Выводы
В ходе исследования были показаны:
1. Успешная трансплантация предложенного вектора и способность генно-клеточной конструкции к длительной экспрессии рекомбинантного белка NGF.
2. Способность NGF-экспрессирующих МКПК к миграции и хоумингу в коре и гиппокампе головного мозга.
Высокий уровнь экспрессии маркеров нейрональной пролиферации нестина и даблкортина, превышающий в группах Alz-NGF на сроках трансплантации 7 и 48 суток показатели экспрессии данных маркеров у групп Alz и WT.
Полученные данные могут быть использованы в дальнейших исследованиях по разработке способов лечения болезни Альцгеймера.

Благодарности
Выражается благодарность за помощь в подготовке и выполнении работы:
Кафедре физиологии человека и животных КФУ
OpenLab «Генные и клеточные технологии» КФУ
Междисциплинарному центру «Аналитическая микроскопия» КФУ
Кафедре нормальной физиологии КГМУ