Половой хроматин и клинико-патофизиологическое значение его определения. Тема 2

Цель занятия:
выявление полового хроматина
*в ядрах соматических клеток человека:
- слизистой буккального эпителия;
- нейтрофилов крови;
*решение генетических задач;
*скрининг-тесты для генных наследственных обменных болезней человека.

Половой хроматин (тельце Барра) — материал генетически инактивированной X-хромосомы,
в норме выявляемый только в соматических (диплоидных) клетках женщин с кариотипом 46ХХ.
В гранулоцитах половой хроматин выглядит как «барабанная палочка».
Число Х-хромосом у индивида равно числу телец полового хроматина плюс один.

В клетках различных тканей (в различных популяциях) половой хроматин выявляется с неодинаковой частотой: 80—90 % нервных клеток содержат половой хроматин,
тогда как в клетках буккального эпителия половой хроматин обнаруживается со средней частотой 20—40 %.

Половой хроматин локализуется в ядре, чаще всего прилегая к ядерной оболочке, с которой он связан тонкими нитями.
Реже он располагается около ядрышка или в середине ядра.
Если половой хроматин прилегает изнутри к ядерной оболочке, он имеет форму треугольника, с вершиной, направленной в сторону центра ядра, или имеет полусферическую форму.

Все организмы, в кариотипе которых
имеются две Х-хромосомы,
содержат одно тельце полового хроматина.
При трисомии по Х-хромосоме в ядрах клеток содержится по два тельца полового хроматина.
Существует обратная зависимость между пролиферативной активностью клеточной популяции и частотой встречаемости телец полового хроматина.

Объекты исследования Х-хроматина — клетки буккального эпителия, эпителиальные клетки мочевого осадка, нейтрофилы крови и др.
В онтогенезе половой хроматин появляется рано, до того, как у эмбриона закладываются гонады.

Изучение полового хроматина используется для верификации хромосомного пола (1),
диагностики хромосомных аберраций по половым хромосомам (2),
для ориентировочного прогноза
пролиферативной активности опухолей (3).

На 5—6-й день эмбрионального развития сначала в клетках трофоэктодермы, затем — в других частях зародыша осуществляется инактивация одной из каждых двух гомологичных хромосом,
включая и одну из двух Х-хромосом у зародышей женского пола.

Механизм этого явления связан с метилированием ДНК инактивируемой хромосомы.
Специальный участок Xq27.3 на Х-хромосоме («островок CpG») содержит множественные цитозин-гуаниновые повторы, которые в геноме эукариот могут метилироваться.
Так, они полностью метилированы в тельце Барра и не метилированы (активны) в единственной мужской Х-хромосоме, как и в активной женской.

У человека развитие мужского пола предопределено наличием Y-хромосомы.
В присутствии любого количества Х-хромосом одной Y-хромосомы достаточно для формирования организма по мужскому типу.

Ген SRY, находящийся в Y-хромосоме, срабатывает на 6—7-й неделе эмбриогенеза,
запуская в действие ряд генов, локализованных в других хромосомах и обеспечивающих программу синтеза тестостерона.
Фетальный тестостерон направляет развитие зародыша по мужскому типу.

Продукция тестостерона и антимюллерова ингибирующего пептида в гонадах плода
предопределяет
(2—3-й месяц эмбриогенеза) формирование внутренних половых органов по мужскому типу.

Метаболит андрогенов
(5-альфа-дигидротестостерон),
не конвертируемый в эстрогены,
контролирует маскулинный тип формирования наружных гениталий на 3—4-м месяце фетогенеза (соматический пол).
Часть тестостерона плода метаболизирует в эстрогены.

При наличии Y-хромосомы и высокой продукции тестостерона
обеспечивается высокое содержание метаболитов эстрогенов, подавляющих формирование обратной связи между продукцией лютеинизирующего гормона (ЛГ) и эстрогенов в развивающемся мозге.

Это ведет к установлению мужского нециклического типа гипоталамо-гипофизарной регуляции половых функций
и обеспечивает на 4—6-м месяце фетогенеза
мужской тип дифференцировки головного мозга,
что лежит в основе нейропсихической маскулинизации в последующей жизни.

Созревание центров секреции гонадотропинов идет под контролем эстрогенов, полученных из тестостерона,
а центров, определяющих половое влечение, — под совместным контролем андрогенов и их ароматических эстрогенных производных.
Центры, ответственные за поддержание поведения,
соответствующего избранной половой роли,
у мужчин организуются под влиянием
только андрогенов.

При отсутствии гена SRY, даже если кариотип 46ХХ, а не 45X0 (синдром Шерешевского — Тернера),
описанные события не происходят,
и
формируется
соматический и психический
женский тип.

Под наследственными понимают заболевания с
первичными техническими дефектами в программном аппарате клеток, передаваемые
по наследству через гаметы.

Моногенные наследственные заболевания контролируются одним геном и поэтому наследуются в соответствии с законами Менделя (например, гемофилия А).
Полигенные наследственные болезни контролируются суммарным эффектом нескольких генов, расположенных в разных частях генома и имеющих неодинаковые свойства.

Полигенные наследственные болезни наследуются по
аддитиво-полигенному типу, как правило, с пороговым эффектом по воздействию того или иного лимитирующего фактора внешней среды (например, сахарный диабет).

Важно помнить, что мутации, хотя и лежат в основе патогенеза наследственных болезней, но не тождественны самому понятию «наследственная болезнь».
Для возникновения наследственных болезней -как и для возникновения других заболеваний - необходимо действие причинных факторов и существенно влияние условий и реактивности организма.

Работа 1.
Определение полового хроматина в соскобе
со слизистой полости рта

Перед взятием соскоба со слизистой щеки несколько раз зубами сжать слизистую, затем проглотить слюну и шпателем сделать соскоб с данного места слизистой щеки.
Полученный материал перенести на предметное стекло и размазать по стеклу.

Не давая материалу подсохнуть, наносят на мазок 1—2 капли 1 % уксуснокислого орсеина.
При отсутствии орсеина окраску можно производить 0,2—0,5 % раствором толуидиновой
(или метиленовой) синьки или азура 1, имеющими рН 4,5—4,7.

Через 1—2 мин на мазок накладывается покровное стекло, а поверх него — кусочек фильтровальной бумаги, сложенной в 4 раза. Большим пальцем прижимают фильтровальную бумагу и покровное стекло к предметному стеклу.
Таким образом достигается равномерное распределения клеток эпителия в один слой.

Половой хроматин

Слева: клетки буккального эпителия. Красная стрелка указывает на глыбку полового хроматина (тельце Барра).
Справа: Ядро фибробласта женщины, окрашенное флуоресцентным красителем. Стрелками указано тельце Барра

Работа 2. Нахождение Х-хроматина в нейтрофилах крови человека
Окрашенный мазок крови просматривают под иммерсионным увеличением, внимательно изучают сегментоядерные нейтрофилы и отыскивают 100 нейтрофилов, отмечая количество клеток, содержащих Х-хроматин — «барабанные палочки».
В протоколе:
а) нарисовать нейтрофилы, содержащие Х-хроматин («барабанные палочки»);
б) подсчитать частоту встречаемости нейтрофилов,
содержащих «барабанные палочки».

Половой хроматин

Ход анализа полового хроматина:
1. Получение клеточного материала.
Источник – разнообразные ткани, но предпочтительны те, что не нужно культивировать in vitro.
Для определения Х-хроматина у взрослого человека используют чаще всего мазки со слизистой оболочки щеки, реже слизистой оболочки влагалища, а также клетки волосяных фолликулов.
Перинатальная диагностика проходит с использованием амниотических клеток.
Для определения численности У-хроматина используется перечисленные ткани, а также сперматозоиды и культивируемые лимфоциты.
В целом для анализа Х-хроматина и У-хроматина идеально подходят однослойные культуры клеток, обычно фибробластов.

2. Фиксация препаратов раствором метанола или смесью этанола и уксусной кислоты (3:1) или исключительно этанолом.
3. Дегидратация путем переноса (ТОЛЬКО для анализа телец Барра) препарата из одного раствора в другой с выдержкой в каждом в течение 5 минут: в спирте 70°, в спирте 50°, в дистиллированной воде I, в дистиллированной воде II.
4. Гидролиз (ТОЛЬКО для анализа телец Барра) в НСl (необязательно).

5. Окрашивание полового хроматина.
Методы окраски X- и Y-хроматина различны. Х - хроматин окрашивается препаратами на основе нефлюоресцирующих красителей: основной фуксин, тионин, ацетоорсеин, толуидиновый синий и др. У – хроматин окрашивается флюорохромами — производными акридинового оранжевого: акрихином, акрихин-ипритом, акрихин-пропилом.
Препараты выдерживаются в краситиле от 30 минут до 12 часов.
Препараты Х-хроматина высушивают и изучают с масляной иммерсией в проходящем свете.
Препараты У-хроматина заключают в специальный буферный р-р и изучают в ультрафиолетовом свете с помощью люминесцентного микроскопа.
Анализ проводят на разъединенных, распластанных клетках.
Срезы тканей для определения полового хроматина используют лишь тогда, когда невозможно получить мазки или препараты-отпечатки среза органа.

Работа 3. Скрининг-тесты наследственных обменных болезней человека
А. Определение фенилаланина в моче человека (проба И. А. Феллинга)
К пробе мочи (2 мл) добавить 6 капель 10 % раствора хлорного железа.
Появление сине-зеленого окрашивания мочи указывает на положительный результат пробы (реакция положительна при содержании фенилаланина в моче более 15 мг %).

Фенилкетонурия (ФКУ) – это нарушение метаболизма аминокислот, приводящее к возникновению клинического синдрома умственной отсталости с когнитивными и поведенческими расстройствами, вызванными повышенным уровнем фенилаланина.
Наследуется аутосомно-рецессивно.

фенилаланин – незаменимая аминокислота, строительный блок белков.
При фенилкетонурии (наследстевнная ферментопатия, дефект гена РАН (12q23.2; ген фенилаланингидроксилазы)
нарушено нормальное превращение фенилаланина в тирозин как результат недостатка фенилаланингидроксилазы
(A.Folling,1934, 98%),
фенилаланин накапливается в крови и превращается в фенилпировиноградную кислоту = нейротропный яд.
➤ судорожный синдром, олигофрения (фенилпировиноградная олигофрения).

При своевременной диагностике можно полностью избежать патологических изменений, если с рождения и до полового созревания ограничить поступление в организм фенилаланина с пищей.
Позднее начало лечения хотя и даёт определённый эффект, но не устраняет развившихся ранее необратимых изменений ткани мозга.

При рождении ребёнка в роддомах
на 3—4 сутки берут анализ крови и проводят неонатальный скрининг для обнаружения врождённых заболеваний обмена веществ.
На этом этапе возможно обнаружение фенилкетонурии и
возможно раннее начало лечения для предотвращения необратимых последствий.

В. Определение гомогентизиновой кислоты в моче человека (проба А. Гаррода)
К 0,5 мл мочи больного алкаптонурией добавить
5 мл 5 % раствора азотнокислого серебра и несколько капель 10 % раствора аммиака. Появление черного окрашивания указывает на положительный результат пробы
(наличие в моче гомогентизиновой кислоты).

Алкапто́нури́я — наследственное заболевание, обусловленное выпадением функций оксидазы гомогентизиновой кислоты и характеризующееся расстройством обмена тирозина и экскрецией с мочой большого количества гомогентизиновой кислоты.
На примере алкаптонурии сэр Арчибальд Эдвард Гаррод в 1909 году разработал концепцию метаболического блока.

Концепция метаболического блока de facto основана на принципе
«один ген - один фермент - один признак (симптом)»
(принцип Бидла - Тейтама).

Согласно концепции метаболического блока, при наследственном заболевании имеется дефицит белка-фермента.
Это ведет к нарушению определенной биохимической реакции.
Создается избыток вовлеченного в эту реакцию субстрата.
Часть его может выделяться из организма или откладываться в тканях
(«болезни накопления» или тезаурисмозы ).

Избыток субстрата может вовлекаться в альтернативные превращения, давая такие продукты, которые отсутствуют или имеются лишь в виде следов в норме.
Помимо избытка субстрата и действия альтернативных продуктов ( которые могут быть токсическими), часть симптомов наследственных болезней порождается нехваткой конечных продуктов блокированной реакции и подавлением реакций, следующих в цепи превращений за блокированным этапом.

Помимо избытка субстрата и действия альтернативных продуктов
( которые могут быть токсическими), часть симптомов наследственных болезней порождается
нехваткой конечных продуктов блокированной реакции и подавлением реакций, следующих в цепи превращений за блокированным этапом.

Современная трактовка принципа Бидла-Тейтама и положений Гарода о метаболическом блоке сильно изменилась по сравнению с оригинальной, поскольку появилось много новых данных, не укладывающихся в классическую схему:
1. Не все гены кодируют белки. Некоторые из них кодируют транспортные и рибосомальные РНК.

2. Не все белки, кодируемые генами - ферменты.
Множество наследственных болезней не связано с дефектом какого бы то ни было фермента, так как при них поражаются гены, кодирующие неэнзиматические белки.

3. Один белок кодируется чаще всего не одним геном, а несколькими, причем каждый ответственен за структуру одного полипептида в составе белка.
4. Гены в генотипах взаимодействуют, и, в силу этого, существует явление плейотропии - множественного действия гена.

Алкаптонурия возникает вследствие мутации гена, кодирующего синтез оксидазы гомогентезиновой кислоты.
Данная патология характеризуется
аутосомно-рецессивным
типом наследования.
Алкаптонурией чаще болеют мужчины.
Ген оксидазы гомогетинзиновой кислоты человека (HGD) локализован на длинном плече
3 хромосомы человека (3q 21-23).

В нормальных условиях гомогентизиновая кислота — промежуточный продукт распада тирозина и фенилаланина — переводится в малеилацетоуксусную кислоту,
из которой в конечном счёте образуются фумаровая и ацетоуксусная кислоты, вступающие в другие биохимические циклы.

Из-за дефекта фермента этот процесс тормозится, и остающаяся в избытке гомогентизиновая кислота превращается полифенолоксидазой в хиноновый полифенол (алкаптон или бензохинонацетат), который и выводится почками.

Алкаптон - если он не полностью экскретируется с мочой - откладывается в хрящевой и другой соединительной ткани,
обусловливая их потемнение и повышенную хрупкость.
Чаще всего первой появляется пигментация склер и ушных хрящей.
Радикального лечения нет, используется симптоматическая терапия и большие дозы аскорбиновой кислоты.

Г. Определение меди в моче человека
Пробу мочи больного гепатоцеребральной дистрофией (болезнь Вильсона — Коновалова) нанносят на фильтровальную бумагу и высушивают.
На высушенную пробу мочи наносят каплю реактива (непосредственно перед постановкой реакции
растворить в 5 мл ацетона 0,1 г ортотолуидина и 0,5 г роданистого аммония).
Появление в течение 30 сек синего окрашивания указывает на положительный результат
(экскреция меди повышена).

Болезнь Вильсона — Коновалова (Гепатоцеребральная дистрофия, гепатолентикулярная дегенерация, болезнь Вестфаля — Вильсона) —
наследственное нарушение метаболизма меди, приводящее к тяжелейшим поражениям центральной нервной системы и внутренних органов.

Диагностируется у 5-10 % больных циррозом печени дошкольного и школьного возраста. Заболевание передаётся аутосомно-рецессивно.
Ген ATP7B, мутации которого вызывают заболевание, расположен на 13-й хромосоме (участок 13q14-q21)
Ген кодирует P-тип АТФазы, которая транспортирует медь в желчь и включает её в церулоплазмин.

Аутосомно-рецессивный тип наследования болезни Вильсона.
25 % вероятность рождения больного у родителей-гетерозигот

Английский невролог Сэмюель Вильсон
( S. Wilson, (1878 - 1937) в 1912 году
описал у больных:
* типичные изменения в головном мозге,
*клинику нового заболевания,
*установил постоянное наличие цирроза печени
* и назвал патологию
прогрессивной лентикулярной дегенерацией
(лат. lenticularis чечевицеобразный).

Было предположено, что ген PRNP
(кодирует прионный белок, активен в головном мозге и других тканях)
участвует в транспорте меди.
А вариации в гене PRNP могут изменить течение болезни, увеличивая возраст появления заболевания и влияя на тип симптомов, которые развиваются.

Медь в организме выполняет множество функций.
В основном она является кофактором для таких ферментов, как
церулоплазмин, цитохром -С-оксидаза,
дофамин бета гидроксилаза, супероксиддисмутаза и тирозиназа.
Медь всасывается из ЖКТ в тонкой кишке: транспортный белок на CMT1 ( Copper Membrane Transporter 1) перемещает медь внутрь клеток.

Часть меди связывается с металлотионеином, а другая — перемещается в аппарат Гольджи с помощью транспортного белка ATOX1.
В аппарате Гольджи в ответ на повышение концентрации меди
фермент ATP7A ( Copper-transporting ATPase 1)
высвобождает этот элемент через воротную вену в печень.

В гепатоцитах белок ATP7B
1) связывает медь с церулоплазмином и высвобождает его в кровь,
2) удаляет избыток меди с выделяющейся жёлчью.
При болезни Вильсона обе функции ATP7B нарушены.
Медь накапливается в ткани печени; церулоплазмин продолжает выделяться, но с недостатком меди (апоцерулоплазмин)
и быстро разрушается в кровотоке.

Когда меди в печени становится больше,
чем белков её связывающих,
происходит их окислительное повреждение .
Это приводит к гепатиту, фиброзу
и в итоге к циррозу.
Также из печени в кровоток выделяется медь, которая не связана с церулоплазмином.
Эта свободная медь оседает по всему организму, особенно в почках, глазах и головном мозге.

Основную роль в патогенезе играет накопление меди в нервной ткани
(особенно поражены базальные ганглии),
почках, печени и роговице и токсическое повреждение медью данных органов.
Нарушение метаболизма выражается в нарушении синтеза и снижении в крови концентрации церулоплазмина.

Церулоплазмин участвует в процессе выведения меди из организма.
В печени формируется крупноузловой или смешанный цирроз.
В почках в первую очередь страдают проксимальные канальцы.
В головном мозге помимо особенно сильного поражения базальных ганглиев, поражаются зубчатое ядро мозжечка и черная субстанция.
Отложение меди в десцеметовой мембране глаза приводит к формированию кольца Кайзера-Флейшера.

Кольца Кайзера-Флейшера:
желтовато-зелёная или зеленовато-коричневая пигментация по периферии роговицы на десцеметовой мембране (задняя пограничная мембрана).
Кольца - отложения меди на границе роговицы и склеры внутри от лимба роговицы, в первую очередь появляются в форме полулуния на верхнем крае роговицы.

Лечение
Патогенетическое лечение направлено на выведение меди из организма. Для этого применяются комплексообразующие соединения: тиолы, пеницилламин. Лечение пеницилламином сопровождается заметным улучшением состояния больных или даже приводит к полной ликвидации симптомов.
Диета № 5 — с ограничением меди до 1 мг в сутки — исключение шоколада, орехов, сухофруктов, раков, печени, цельной пшеницы.
Препаратом выбора является купренил (пеницилламин), который эффективен в 90 % случаев. Д-пеницилламин или унитиол.