Серологические методы исследования

Гемагглютинины вирусов –
гликопротеиновые шипики на поверхности вируса - способны склеивать эритроциты, за что и получили свое название.
Это свойство используют для постановки РТГА
Реакция вирусной гемагглютинации
Вирусная гемагглютинация

РТГА основана на блокаде антигенов вирусов (гликопротеиновых «шипов» - гемагглютининов) антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.
РТГА используют:
для типирования вирусов,
для определения АТ к вирусам в сыворотке пациента
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РТГА применяют для диагностики инфекций, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
На рисунках представлена РТГА для определения АТ в сыворотке пациента.

Связывание антител с антигеном
Нейтрализация вирусов и бактерий
Агглютинация бактерий
Преципитация растворимых антигенов
Активация системы комплемента
Лизис клеток
Фагоцитоз
МАК

Реакция иммунного лизиса.
Это лизис клеток в присутствии антител к ним и комплемента.
Сначала образуется комплекс антиген –антитело, он активирует комплемент.
Активированный комплемент на поверхности клетки формирует МАК, что вызывает разрушение (лизис) клетки.

Реакция связывания комплемента- РСК
заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело.
Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
РСК проводят в две фазы:
1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент;
2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из
эритроцитов барана и гемолитической сыворотки,
которая содержит антитела к эритроцитам.
Такие антитела называются гемолизины, но сами они не лизируют эритроциты. Лизис идет при активации системы комплемента .
Гемсистема- индикаторная система на свободный комплемент!

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана) = РВ =RW
Разведения сыворотки пациента
1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 К-
Титр= 1/320

Твердофазные методы
Основаны на
фиксации одного из компонентов (Аг или Ат) на носителе
с последующим образованием на твердой фазе комплекса Аг-Ат, отмывкой несвязавшихся компонентов и
выявлении образовавшегося комплекса по метке (фермент, флюорохром, изотоп).
Основные твердофазные методы – иммунофлюоресцентный анализ (МФА =РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ (РИА).
Твердая фаза – предметное стекло (МФА, РНИФ),
полистирол или полихлорвинил (ИФА),
специальные подложки -бумага, нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблот).

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ =
Метод флюоресцирующих антител - МФА
МФА может быть прямой и непрямой
Прямой – антитела к искомому антигену соединяют с флюорохромом. Таким препаратом обрабатывают препарат- мазок и затем исследуют в люминесцентном микроскопе.
Непрямой – сначала добавляют антитела к искомому антигену, а затем комплекс антиген-антитело выявляют антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромом.
Полученные препараты изучают в люминесцентном микроскопе.

Токсоплазмы
Гемофильная палочка
РИФ= МФА
Риккетсии в клетках

Твердофазный иммуноферментный анализ - вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшетов из полистирола.
Тест основан на обычном взаимодействии антигенов и антител.
После соединения антигена с антителами и отмывки добавляют КОНЪЮГАТ - антитела, конъюгированные с ферментом-меткой (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
После отмывки добавляют субстрат пероксидазы (ТМБ).
Субстрат расщепляется ферментом, что в конечном итоге приводит изменению цвета продукта реакции: интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Принцип ИФА

Тест- системы для ИФА
С помощью ИФА определяют
антитела
различные белки (антигены возбудителей, гормоны, онкомаркеры, интерлейкины и др.)

ИФА
Результаты ИФА учитываются с помощью фотометра, который переводит интенсивность окраски в числовые значения.
Тест-система для ИФА
Внесение реагентов
Термостат
Аппарат для промывания лунок
Исследуемый материал
Внесение стоп- реагента

Иммуноблоттинг =иммуноблот (ИБ)
blotting paper - промокательная бумага
blot – пятно
ИБ- твердофазный метод определения антител к возбудителю в сыворотке пациента.
Механизм метода сходен с ИФА.
Принципиальное отличие – одновременное определение антител к нескольким антигенам возбудителя (возбудителей).
Для этого смесь антигенов возбудителя разделяют в геле методом электрофореза и переносят их на полоску нитроцеллюлозы.
Процесс исследования аналогичен ИФА. Результат реакции проявляется в виде пятна на тестовой полоске
Окрашивание

иммуноблоттинг

Результат ИБ на ВИЧ
Контроли
Тесты пациентов

Иммунохроматографический анализ- ИХА
Комплект набора:
20 кассет
20 пробирок для разведения проб
Материал для исследования:
фекалии, взятые с 3-5 по 8 дни болезни
Исследуют свежие пробы, хранившиеся не >48 ч при 4-8°C или больший срок при -20°С.
Не использовать консерванты и детергенты!

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТА
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ