Возможные источники ошибок при проведении ДНК-диагностики генных болезней

Генные болезни — заболевания, которые вызываются генными мутациями.
Генные болезни — это большая группа заболеваний, возникающих в результате повреждения ДНК на уровне гена.
К генным болезням у человека относятся многочисленные болезни обмена веществ. Они могут быть связаны с нарушением обмена углеводов, липидов, стероидов, пуринов и пиримидинов.

Примеры:
фенилкетонурия - нарушение превращения фенилаланина в тирозин из-за резкого снижения активности фенилаланингидроксилазы; алкаптонурия - нарушение обмена тирозина вследствие пониженной активности фермента гомогентизиназы и накоплением в тканях организма гомотентизиновой кислоты;
глазно-кожный альбинизм - обусловлен отсутствием синтеза фермента тирозиназы.
болезнь Ниманна-Пика - снижение активности фермента сфингомиелиназы, дегенерация нервных клеток и нарушение деятельности нервной системы;
болезнь Гоше - накопление цереброзидов в клетках нервной и ретикуло-эндотелиальной системы, обусловленное дефицитом фермента глюкоцереброзидазы.
синдром Марфана («паучьи пальцы», арахнодактилия) - поражение соединительной ткани вследствие мутации в гене, ответственном за синтез фибриллина.

Непрямой (косвенный) подход к молекулярной диагностике исторически является более ранним и более универсальным. Он основан на анализе внутри- и внегенных полиморфных сайтов. Эти полиморфные сайты могут располагаться либо внутри самого гена, либо в непосредственной близости от него. Непременным условием косвенной ДНК-диагностики является наличие в семье больного ребенка или возможность исследования его ДНК (пятен крови, гистологических препаратов и др.). Установление информативности предусматривает выявление такого полиморфного сайта, который может быть использован в качестве молекулярного маркера для дискриминации как мутантного, так и нормального аллеля. При этом родители будут являться гетерозиготами по данному полиморфизму, а больной - гомозиготой по одному из маркерных аллелей. Именно гетерозиготность по молекулярным полиморфизмам определяет информативность той или иной семьи высокого риска рождения ребенка. В зависимости от распределения маркерных аллелей на гомологичных хромосомах больного и его родителей семья может быть полностью информативной для ДНК-диагностики, частично информативной или неинформативной. Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска такое количество полиморфных сайтов одного гена, чтобы точно определить, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген, и сделать семью полностью информативной для последующей ПД. Главное преимущество косвенного метода - возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутаций в самом гене. Его существенными недостатками являются невозможность диагностики при отсутствии больного ребенка (нельзя точно определить, с каким полиморфным аллелем сцеплен мутантный ген), ошибка в диагнозе в связи с возможностью кроссинговера в мейозе и переноса полиморфного сайта на здоровый аллель.

Впервые молекулярная (ДНК) диагностика в России была осуществлена в Санкт-Петербурге в 1987 г. у женщины с высоким риском рождения ребенка, страдающего муковисцидозом.

Основные требования при проведении ДНК-диагностики
— точностью клинического диагноза;
— своевременным обследованием семьи высокого риска и больного молекулярными методами;
— правильностью оценки риска рождения больного ребенка;
— выбором оптимального срока ПД; возможностью получения материала плода;
— четкостью рекомендаций после ПД;

Точность молекулярной диагностики, возможные источники ошибок
При проведении пренатальной диагностики молекулярными методами важно помнить о двух основных источниках ошибок:
контаминации плодного образца материнскими клетками;
- возможности кроссинговера при использовании непрямого метода.

Учитывая очень высокую чувствительность метода ПЦР, важно избежать загрязнения образцов плодных тканей материнскими клетками. Особенно важно не допустить попадания материнской крови .Высокая квалификация врача-оператора и использование качественных реакций на выявление примеси материнской крови позволяют избежать этого осложнения. Риск подобных диагностических ошибок может быть значительно уменьшен при работе в стерильных условиях. Более точным является показатель диагностики около 99,9%. Значительно сложнее оценить результаты молекулярной диагностики косвенным методом. В случае учета внутригенных полиморфизмов точность непрямой диагностики достаточно высока, так как величина внутритенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1 % для большинства известных генов. Исключение могут составлять только сравнительно крупные гены, такие как ген дистрофина, гемофилии А, нейрофиброматоза и некоторые другие. Так, в случае дистрофина частота ошибочного диагноза может достигать 2%, что соответствует высокой частоте внутритенного кроссинговера (около 2%) в этом гигантском гене (2,2 млн п.о.). Величина возможной ошибки возрастает, если маркерный аллель определяется не у сибса плода, а у других его родственников.

К настоящему времени в стране проведено более 1000 ПД моногенных болезней. Более 500 из них выполнены в нашем центре, что позволило предотвратить рождение 154 детей с тяжелыми моногенными болезнями, в том числе с муковисцидозом, фенилкетонурией, гемофилией Аи В, миодистрофией Дюшенна, синдромом ломкой Х-хромосомы.