Цитокины семейства Фактора Некроза Опухолей

…Фактор некроза опухолей представляется мне «водородом» всех цитокинов на Земле....(Д.И. Менделеев, из письма Л. Олду)

Фактор некроза опухолей (ФНО, TNFα)
Многофункциональный цитокин (мономер-17кД).
Передает сигналы как клеточной смерти, так и активации экспрессии генов.
Используется в некоторых протоколах противоопухолевой терапии.
Связан с развитием септического шока.
Играет важную роль в развитии иммунного ответа и воспаления, и в поддержании архитектуры вторичных лимфоидных органов
Связан с развитием аутоиммунных заболеваний.

Bharat Aggarwal
George Kollias
David Goeddel
Bruce Beutler
Доска Почета
по отделу ФНО
Lloyd Old

Благодарность за помощь
в подготовке лекций
Дмитрий Купраш
Сергей Гривенников
Ян Вилчек

Mitogenesis,
collagenase, cytokines
Inhibition of
lipoprotein lipase,
insulin resistance
Altered function,
Apoptosis
Activation, apoptosis,
IFN-γ, IL-2,
other cytokines
Activation,
TNF,
IL-1, IL-6,
iNOS
STIMULUS
(Bacteria, Viruses,Cytokines)
Bone
resorption
Acute phase
proteins
Fever,
sleep
Antibodies
iNOS
Cytokines,
adhesion molecules,
coagulation factors,
Monocyte
Endothelium
B cell
T cell
Brain
TNF
Liver
Adipocyte
Fibroblast
Myocyte
Osteoclast
Monocyte/Macrophage

Ligands and Receptors of the LT-TNF Subfamily
LTα3
LTβ2 LTα1
TNF3
TNFRII
TNFRI
LTβR
LIGHT
HVEM
T-cells
Immature DCs
T-cells
B-cells
NK cells
T-cells
B-cells
NK cells?
Macrophages
Neutrophils
Dendritic cells
NK cells
Mast cells
T-cells
B cells
Enterocytes
Endothelial cells
Most cell types
Stromal cells
Macrophages
Mast cells
Dendritic cells
Immature DCs
T-cells
B cells
NK cells
Monocytes
Endothelial cells

Fos
Jun
AP1
p50
p65
IkBα
IKKα
IKKβ
IKKγ
GENE ACTIVATION
MEKK3
NFκB
SODD
JNK
DD
DD
FADD
APOPTOSIS
DD
TNFR1
Pro-caspase-8
Pro-caspase-10
Effector
caspases
TNFR1
TRADD
TNF
c-FLIP
DD
DD
DD
DD
DD
RIP
DED
DED
TRAF2
TAK1
MAP3K
c-IAP1,2
MAPK
phosphatase
Cyt- c
caspase 3
ROS

deleterious
beneficial
Lymphoid
microarchitecture
Host defense
Systemic
toxicity
Autoimmunity
«Плохой» и «хороший» TNF in vivo.

deleterious
beneficial
Lymphoid
microarchitecture
Host defense
Systemic
toxicity
Autoimmunity
«Плохой» и «хороший» ФНО in vivo.
Как ФНО, продуцируемый индивидуальными типами
клеток, вносит вклад в баланс между «плохим» и «хорошим»?

Баланс «полезных» и «вредных» свойств ФНО
Что произойдет при системном блокировании
ФНО у больных (препараты Infliximab, Etanercept)?
- Инфекции (ТБ), лимфомы?

Генетический нокаут: изучение физиологических последствий инактивации одного единственного гена.
Проблема №1: из-за вырожденности функций близкородственных генов генетический нокаут может не «вскрыть» всех физиологических функций продукта гена.
Проблема №2: практически при любой технологии генетического нокаута нельзя полностью исключить нарушения регуляции соседних генов.
Проблема №3: точечная мутация может давать другой фенотип, чем нокаут. (Технология «нок-ин» позволяет воссоздать организм с выбранной точечной мутацией).
Краткое введение в нокауты: «обратная» генетика

Стадии генетического нокаута

Технология генетического нокаута с использованием Cre/loxP или Flp/Frt систем
(precision targeting)
Adapted from Nature Reviews | Genetics

Мишень для генетических манипуляций: локус ФНО-ЛТ мыши
LTβ
LTα
TNF
1 kb
Receptors:
TNFR1 Mouse chromosome 6
LTβR Mouse chromosome 6
TNFR2 Mouse chromosome 4
Chromosome 17
MHC class III
MHC class I

Панель мышей с кондиционной инактивацией гена ФНО
Mice with
“floxed” TNF gene
loxP
X
Mice with TNF gene deletion
in specific cell types
X
=
“Deleter” mice with
restricted expression
of Cre recombinase
CD4-Cre
=
X
CD19-Cre
Mx-Cre
=
MLys-Cre
=
Macrophages, neutrophils
X
loxP
TNF
Inducibly, in all cells

Эффективность и специфичность делеции гена ФНО в М-ФНО мышах
0
200
400
600
800
TNF, pg/ml
WT
M-TNF
0
200
400
600
800
1000
1200
TNF, pg/ml
TNF KO
WT
M-TNF
0
1
2
3
4
5
M-TNF
WT
TNF KO
TNF, ng/ml
клетки брюшной
полости
нейтрофилы
сыворотка
wt
M-ФНО
wt
TNFΔ
mTNF
wt
M-ФНО
GAPDH
селезенка
печень
Костный
мозг
wt
TNF Δ
тимус
PEC
M-ФНО
ФНО КОО
wt
ФНО
KO
M-ФНО
CD11b+
Gr1high
wt
TNFΔ

Макрофаги и нейтрофилы являются главным источником «системного» ФНО
Survival, %
0
20
40
60
80
100
0
5
20
Hours
40
WT, T-TNF, B-TNF
TNF KO, M-TNF
0
1
2
3
4
5
M-TNF
T-TNF
B-TNF
WT
TNF KO
TNF, ng/ml
Уровень ФНО в сыворотке
ЛПС / D-Gal токсичность

0
1
2
3
5
TNF, ng/ml
medium
LPS
HKLM
CpG
BLP
WT
MN-TNF KO
TNF KO
4
ФНО является геном-мишенью при активации многих TLR рецепторов

ФНО, продуцируемый как макрофагами, так и Т лимфоцитами, является медиатором токсичности к продукту Грам-положительных бактерий, SEB

Pathology score
ALT activity, U/ml
T-TNF KO
B-TNF KO
TNF KO
MN-TNF KO
WT
WT
TNF KO
MN-TNF KO
T-TNF KO
B-TNF KO
AST activity, U/ml
WT
TNF KO
MN-TNF KO
T-TNF KO
B-TNF KO
1
2
3
4
5
0
1000
2000
3000
4000
0
1000
2000
3000
4000
Как T-ФНО, так и MН-TNF, являются медиаторами
экспериментального аутоиммунного гепатита

ФНО, производимый как макрофагами, так и
T клетками, необходим для защиты от инфекции внутриклеточными патогенами
B-TNF KO
M-TNF KO
T-TNF KO
TNF KO
WT
0
20
40
60
80
100
Выживаемость, %
2
4
6
8
Дни
0
10
2
4
6
8
10
M-TNF
TNF KO
WT
B-TNF
T-TNF
Log CFU
Листерия -модель
внутриклеточного патогена
Количество бактерий в печени

TNF KO
WT
CD11b
iNOS
bacilli
TNF induces granuloma formation and antibacterial mechanisms
Granuloma- macrophages + CD4 T cells
activation of macrophages
expression of iNOS
chemokines/more cells
2) Granuloma formation requires TNF
anti-TNF or TNF KO- no granuloma
BCG expressing TNF- restoration of granuloma
3) TNF is produced by macrophages and by T cells
4) Blockade of TNF leads to TB reactivation

T cell
TNF
TNF
Macrophage
SEB
?
IFNγ
ConA
TNF amplification in response to polyclonal T-cell activation
TNFR1

Кооперация ФНО, продуцируемого В и Т лимфоцитами, в развитии и поддержании структуры лимфатических узлов
CR1
B220
CD3
wt
B-TNF
T,B-TNF
T-TNF

Soluble TNF from B cells, but not from T cells (?) is critical for the maintenance of lymphoid organ structure

100
75
50
25
0
0
50
200
250
300
350
Days post i.p. inoculation 3logLD50
Percentage survival
B-TNF 9/11
TNF 2/7
wild type 5/5
Задержка терминальной фазы прионной болезни у B-TNF KO мышей

FDC precursor
in spleen
FDC precursor
in lymph node
FDC precursor
in Peyer’s patch
B cell
TNF
T cell
TNF
TNFR1
Target genes
TNFR1
Target genes
B cell
TNF
TNFR1
Target genes
Роль ФНО, продуцирумого B и T лимфоцитами,
в развитии фолликулярных дендритных клеток
во вторичных лимфоидных органах

Superantigen induced
shock
Autoimmune hepatitis
MN-TNF
T-TNF
deleterious
beneficial
TNF
MN-TNF
T-TNF
deleterious
beneficial
TNF
Intracellular pathogen
beneficial
deleterious
MN-TNF
T-TNF
TNF
LPS induced
toxicity
deleterious
beneficial
TNF
Выводы: сложный баланс между защитными и разрушительными функциями ФНО in vivo.
B-TNF
B-TNF
Lymphoid tissue maintenance, prion transmission

Рекомбинантный ФНО имеет ярко выраженный противоопухолевый эффект (некроз опухолей) на модельных опухолях мышей.
Опухоли, экспрессирующие ФНО, растут медленно или отторгаются.
Может ли ФНО быть компонентом системы «иммунологического надзора» над возникающими опухолевыми клетками?
Инактивация ФНО защищает мышей от химически –индуцированных опухолей кожи.
ФНО и рак

Является ли ФНО компонентом
системы «иммунного надзора»?
0%
50%
100%
0
10
20
30
40
Weeks
Survival
p53 KO
p53-TNF KO
100
80
60
40
20
0
Percent mice tumor free
0
10
20
Weeks
129/Sv
x p53-/-
IFNγR-/-
x p53-/-
IFNγ/p53
TNF/p53
30

Мыши, «гуманизированные» по локусу ФНО/ЛТ, -
модель для изучения последствий блокировки ФНО
Cosmid 031A
LTβ
TNF
LTα
LST1
(humTNF/LT)Tg
(musTNF/LT)WT/Δ
(musTNF/LT)Δ/Δ
human TNF/LT
mouse TNF/LT
+
+
+
-
-
+
-
-
Assessment of immune and host defense responses
Pathological examination

Production of human and mouse TNF by different lines of Hu-TNF/LT Tg KO mice in vivo
B
(A and B). TNF levels in sera after ip injection of 100 mcg LPS. (C). Mice survival after ip injection of 10 μg LPS+20mg D-GalN.
C
A

Human TNF/LT transgene rectifies the response
to a non-replicating TD antigen, SRBC, and renders transgenic mice
completely protected against M. tuberculosis
Body weight
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
1010
CFU/lung