Методы генетического анализа

Волошина Марина Александровна
ИЦиГ, лаб. генетики популяций (Захаров), c.н.с, к.б.н.
к. 1220 гл. корпуса.
Тел.лаб. 363 49 39 * 1220
Моб. [phone]
Е-мэйл: [e-mail]
Сайт: biologii.net

Познакомиться с классическими
и современными методами работы с дрозофилой
Цели практикума

Основы работы с мухами

Самец или самка?
Первый признак самца – «точка» на конце брюшка (половой аппарат)
На размер ориентироваться нельзя! (зависит от условий питания личинки)
♀
♂
♂
♀

♀
♂

Самый надежный признак – половые гребешки на передних лапках самца

Размножение линий
Для поддержания линии мух просто пересыпают на свежий корм, можно не замаривать
Старые стаканы не выбрасывайте
из них можно собрать самок при необходимости
вновь пересаженные мухи могут «не пойти» - плесень, переморены, влипли

Как собирать девственных (виргинных) самок
Все дело в самцах!
Они становятся фертильными ~ через 6 часов после вылупления из куколки.
У дрозофилы выраженный суточный ритм – пик вылупления в утренние часы (любящая росу)
За сутки до вылупления сквозь куколку начинают просвечивать черные крылья

Утром выбросить всех мух (проверить, чтобы никто не влип в корм и не остался)
Не позже, чем через 6 часов собрать всех вылетевших за это время самок.
Посадить их в отдельную пробирку, оставить ее в лежачем положении.
Использовать лучше в возрасте 3-10 дней, позже яйценоскость самок падает.

На крайний случай
если вы не успели придти через 6 часов
или куколок в пробирке мало
Можно брать самок, по которым видно, что они только что вылупились:
с нерасправленными крыльями
очень светлых – зеленоватых (такими они остаются около часа после вылупления)

Если вы не уверены в своих самках
Не сажайте их слишком много в пробирку – не более 5-6
может затесаться самец или одна самка оказаться не девственной
Подержите несколько дней и проверьте, не началось ли там развитие личинок
если началось –придется всех выбросить
Помните, что девственные самки тоже откладывают яйца – только они не развиваются

Подумайте, насколько критична девственность для вашего скрещивания – сможете ли вы отличить среди потомков и выбросить тех, что от «неправильного» самца.
Лучше собирать самок в хорошо идущих линиях, а из более слабых брать самцов.

Не перемаривайте мух!
1 минуты вполне достаточно –
как только перестали двигаться
Не наливайте слишком много эфира!

Эфир наливаем, вытащив воронку, а не через нее
(прямой контакт с эфиром мух убивает)

В один стаканчик ~ по 5 самок и самцов
Самца можно и одного. Иногда это необходимо – индивидуальные скрещивания.
Если нужно поставить индивидуальное скрещивание самки, то берут не стаканчик, а пробирку (поменьше).
Пока мухи не проснутся – пробирка в лежачем положении!
ИНАЧЕ ВЛИПНУТ В КОРМ

Каждую пробирку – сразу подписать !!!
Линия / cкрещивание
Дата

В одной связке – одна линия
или одно скрещивание
Можно ставить бумажную этикетку – что делать с F1
Обязательно пишите дату – иначе у вас может там оказаться F2

Яйцо
Личинка 1 возраста
Имаго
Куколка
Предкуколка
Личинка 3 возраста
Личинка 2 возраста
10 дней
~ 5-й день

Через 3-5 дней родителей удаляем из пробирки.
Можно перебросить на новый корм, если нужно много потомков.
Потмоков собираем не реже раза в два дня. Если некогда их просмотреть сразу – хотя бы отсадить на новый корм (иначе погибнут)

Температура важна!
Ни одно яйцо не будет отложено при температуре
Оптимум – 25˚
Температура влияет на частоту кроссинговера

Генетический анализ неизвестной мутации
Тема 1

Фенотипическое описание
Видимые проявления, плейотропная или нет
Пенетрантность и экспрессивность
Жизнеспособность, если снижена – на каких стадиях гибель
Определить отношения доминирования
с нормой
с другими аллелями данного гена, если ген известен.

Картирование
Определить хромосому
Определить локализацию в хромосоме.
Установить, является ли новая мутация аллелем уже известного гена.
Поиск в установленном районе хромосомы мутаций с аналогичным фенотипом по Красной книге и Fly Base.
Тест на комплементарность с генами-кандидатами.

План работы
Скрещивание 1.
Мутация × дикий тип
F1
F2
(Canton S или Оregon R)
P1
P2
Цели – определить:
доминирование
сцеплена или нет с полом
жизнеспособность по сравнению с нормой

Линия , в которой хромосомы 2 и 3 маркированы доминантными мутациями:
Cy (Curly, 2) – загнутые вверх крылья, БАЛАНСЕР
L (Lobe, 2) ­– уменьшенные глаза
D (Dichaete, 3) – расставленные крылья, БАЛАНСЕР
Sb (Stubble, 3) – короткие щетинки
Метод доминантных маркеров
Картирование до хромосомы

P2
P1
F1
Метод доминантных маркеров
♀♀
♂♂
×
♂ и ♀
♂ F1
×
♀♀

P2
Метод доминантных маркеров
♂ F1
×
♀♀
+
Sb
и
Мутантный фенотип m никогда не будет встречаться вместе с доминатным маркером той же хромосомы, где расположена мутация m

Рабочий журнал

Пронумеруйте страницы и сделайте оглавление
Ведите журнал не по датам, а по экспериментам – эксперимент 1, эксперимент 2, …
В начале каждого раздела – описание линий и схема скрещивания
Далее – даты и результаты
На отдельной странице записываются возникшие проблемы и их решение