Методы и исследования микориз и микоризообразующих грибов

Микориза
– эволюционно сложившийся структурно оформленный симбиоз, необходимый для одного или обоих партнеров, между грибом и корнем (или иным контактирующим с субстратом и осуществляющим транспорт веществ органом) живого растения. Микоризы развиваются в специализированных органах растений, где тесный контакт между симбионтами является результатом синхронного развития. Микоризные симбиозы представляют собой континуум от мутуалистических до паразитических взаимоотношений, и положение в нем определяется видовой принадлежностью симбионтов, факторами окружающей среды и возрастной стадией симбиоза.

Микориза :
структура - модифицированная часть корня, заселенная грибом-микоризообразователем (= микоризное окончание)
тип трофических взаимоотношений между корневой системой растения и микобионтом (= микотрофия)

Арбускулярная микориза (АМ)
Образуют: около 200 видов грибов ( отд. Glomeromycota),
около 300 тыс. видов растений, преимущественно травянистых.
Распространены повсеместно, преобладают в тропиках, где отсутствует сезонность, а для почв характерно низкое содержание органики.
арбускула
- древовидно разветвленная гаустория в коровой клетке

Арбускулярная микориза (АМ)
везикулы
- запасающие структуры внутри тканей растения
- пропагулы, запасающие структуры на свободном мицелии в почве
«спорокарп»
хламидоспоры

Арбускулярная микориза (АМ)

Типы микориз
Эктомикориза
Образуют: около 6 тыс. видов грибов (преимущественно Агарикоидные, отд. Basidiomycota, реже представители отд. Ascomycota ), часто cпецифичные к хозяину около 5-6 тыс. видов растений, почти исключительно древесных или кустарников.
Преобладают в лесах умеренной зоны с выраженной сезонностью и высоким содержанием органики в почвах.

Эктомикориза (ЭМ)
Характерны морфологические изменения корневой системы, заселенной микобионтом
Чехол (М) – на поверхности корня, от чехла отходят в почву наружные (свободные, экстраматрикальные) гифы
Сеть Гартига (стрелки) – в эпидермисе и коре

Распространенность микориз среди групп растений
82% наземных растений принимает участие в микоризных симбиозах Покрытосеменные: микотрофны 75% Однодольных и 80-90% Двудольных
Голосеменные – 100%
Ряд видов споровых растений и мохообразных

История исследования микориз
Каменский
Франц Михайлович
(1851 – 1913)
1881 – Die Vegetationsorgane der Monotropa hypopitys L. (Botanische Zeitung)
1886 – О симбиотическом соединении мицелия грибов с корнями высших растений
(Тр. СПб об-ва естествоиспытателей)

История исследования микориз
1885 - А.Б. Франком введен термин «микориза»
До 1920-х – преимущественно исследования анатомии и морфологии микориз различных типов, первые попытки культивирования грибов- микоризообразователей, дискуссии о пользе и вреде микориз для растения
1920-е – серед. 1950-х – выделение чистых культур, попытки синтеза микориз in vitro, вопросы применения микориз в лесоводстве и сельском хозяйстве, активные исследования арбускулярной микоризы
Конец 1950-х – начало 1990-х – изучение физиологии микориз с применением изотопных методов, эколого-ценотические исследования микосимбиотрофизма

История исследования микориз
В настоящее время исследования представлены следующими направлениями:
Анализ отношений симбионтов на молекулярно-генетическом уровне, выявление природы сигналов, определяющих возникновение и развитие симбиоза
Изучение филогении микоризообразующих грибов и эволюции микоризных симбиозов
Анализ биотических связей микориз с другими группами организмов
Оценка влияния специфичности микориз на структуру растительных сообществ
Оценка роли микориз в восстановлении сообществ после нарушений, в особенности, антропогенных

Физиология растений
Фитоценология
Прикладные исследования в лесоводстве и сельском хозяйстве

Отбор образцов арбускулярной микоризы
для анализа
У трав с мочковатыми корнями последние берут почти полностью.
У растений со стержневой корневой системой собирают лишь самые тонкие корни, толщиной не более 1 мм, потому что именно в них находится микобионт.
фиксаторы:
4% формалин,
70% этанол

Отбор образцов эктомикоризы для анализа
У сеянцев – отбор корневой системы целиком
У взрослых деревьев – отбор корневых образцов из шурфа
Лопатой, совком или тупым ножом обнажают тончайшие корневые ответвления изучаемого растения, выбирают только свежие активные корневые окончания. Важно убедиться, что взяты корни именно того растения, которое необходимо.
В большинстве случаев максимум развития микориз у древесных растений приходится на 5—20-см слой почвы, то именно с этой глубины берут корни для изучения микориз. Лишь при специальных исследованиях глубинного распределения микориз образцы берут по всем почвенно-генетическим горизонтам.
Если немедленная обработка невозможна, то проводится фиксация материала ацетоформолом, хромово-уксусной смесью или жидкостью Карнуа (по Лобанов, 1971; Селиванов, 1981) .

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
АРБУСКУЛЯРНОЙ
МИКОРИЗЫ (АМ)
цитологические
методы идентификации микобионта (анатомия, молекулярные методы)
методы количественного учета микориз и микобионтов
методы исследования физиологии АМ (получение бинарных культур)
методы получения и применение АМ инокулюма
методы изучения развития симбиоза (молекулярно-генетические)

Цитология арбускулярной микоризы
Структуры АМ не видны невооруженным глазом: корневая система не претерпевает морфологических изменений (иногда наблюдается пожелтение или позеленение корней).
АМ изучают на срезах корней или мацерированном материале.

Цитология арбускулярной микоризы
Осветление корней в 10% р-ре КОН при нагревании (15-20 мин при 121°С в автоклаве или 2-4 часа при 60-90°С на водяной бане) в зависимости от толщины и окраски образцов.
Фрагменты промытых, очищенных от почвы корней длиной 2-4 см,
массой – не более 1-2 г.

Цитология арбускулярной микоризы
окрашивание
кислый фуксин
трипан блю
Окрашивание 0,05% р-ром трипан блю в молочной кислоте с глицерином при нагревании (автоклав – 15 мин, водяная баня – несколько часов) или при комнатной температуре – несколько дней. Краситель не рекомендуется для препаратов для фотосъемки.

Цитология арбускулярной микоризы
Прочие красители:
Хлоразол черный Е (СВЕ) – 0,05% р-р в молочной кислоте с глицерином, наиболее широко применяемый краситель на западе. Дает стабильное контрастное окрашивание, корни можно хранить в 50% глицерине.
Кислый фуксин и анилиновый синий - также используются, но контрастность окрашивания ниже и окрашенные препараты быстро обесцвечиваются.
В отечественной литературе указан в основном раствор анилинового синего в молочной кислоте.
После окрашивания корни осветляют глицерином.
постоянный препарат мацерированных корней

Морфологические особенности спор АМ грибов: идентификация микобионта
Организация спор
Размеры и форма спор
Развитие спор

Морфологические особенности спор АМ грибов: идентификация микобионта
Прорастание спор
Текстура оболочки спор
Окраска спор

Количественный учет арбускулярной микоризы

Количественный учет арбускулярной микоризы

Количественный учет арбускулярной микоризы
Корни (не более 0,1 – 0,2 г) раскладывают на чашке Петри с сеткой с размером ячейки 1/ 2 х 1/ 2 дюйма и под бинокуляром считают число пересечений линий и корней (что будет соответствовать общей длине корней – R1), а также число таких пересечений, где находилась микоризная часть корня (R2). Отношение второй цифры к первой и будет показателем микоризации корней в %.
Определив сырую массу корней в образце, можно после высушивания до постоянного веса определить сухой вес образца. Коэффициент веса, получаемый как отношение сухой массы к влажной, умноженный на полученные по пересечениям с линиями длинам, позволяет вычислить % микоризации для всего образца.

Количественный учет арбускулярной микоризы: метод множественного подсчета по Ormsby et al., 2007

Количественный учет арбускулярной микоризы
Степень микотрофности (М) характеризует обилие гриба в растении.
На каждом исследуемом участке корня (1 см) в пяти полях зрения определяют количество гриба по пятибалльной шкале. Всего просматривают 20 см корня 1-го и 2-го порядков. На основании определения количества гриба на 10 сантиметровых отрезках корня подсчитывают степень микотрофности:
М = А/50
где А — сумма баллов, выражающая количество гриба на 10 см корня и 50 -число полей зрения на этом же отрезке длины .
Частота встречаемости микориз (F) характеризует соотношение инфицированных и стерильных участков корневой системы.
F = n*100/N
где N — общее число просмотренных полей зрения, п — число полей зрения, где обнаружена микориза.
У каждого растения исследуют не менее 20 см корней 1-го и 2-го порядков и просматривают как минимум по 200 полей зрения.

Количественный учет арбускулярной микоризы
Степень микотрофности (М, обилие гриба в корне):
учет в баллах по поперечным срезам
Микобионт в 1-2 клетках.
Микобионт в небольшой группе клеток
Занято 1/4 -1/5 мезодермы
Занято не менее 1/3 мезодермы
Сплошное кольцо микобионта вокруг стелы

Количественный учет арбускулярной микоризы
Степень микотрофности (М, обилие гриба в корне): учет в баллах по препаратам мацерированных корней
Микобионт в отдельных клетках мезодермы
Около 1/4 клеток мезодермы заполнено микобионтом
Половина клеток заполнена
3/4 клеток мезодермы заполнены грибом
Вся мезодерма занята микобионтом

Количественный учет арбускулярной микоризы
Интенсивность микоризной инфекции (С) характеризует обилие гриба в растении.
где
— сумма произведений; n1 — количество срезов с баллом 1;
n2— количество срезов с баллом 2; n3— количество срезов с баллом 3 и т. д.; N— общее число исследованных срезов (с грибом и без гриба);
К — наивысший балл шкалы учета.
Применяется, например, для вычисления среднего значения обилия микобионта по варианту эксперимента или по повторностям.

Способы очистки:
1. центрифугирование в градиенте сахарозы (на дне 50% р-р сахарозы, выше 25% р-р, наверху – вода; споры собираются в зоне 25% сахарозы).
2. разделительное осаждение в желатиновых колонках (на дне застывший 20% желатин, выше 15% желатин, над ним 5%, наверху вода; нагревают на водной бане, через 30 мин охлаждают, споры скапливаются на стыке 5 и 15% желатина. Сегмент колонки вырезают, осторожно растапливают и отфильтровывают).
3. метод флотации (тонкую органическую фракцию помещают в колонку с 50%-ным глицерином и снизу продувают сжатым воздухом через перфорированный диск).
4. центрифугирование в градиенте плотности контрастного вещества (то, что используется при рентгене. Градиент – 60, 40, 20 и 10%).
Методы очистки спор АМ грибов
Споры:
идентификация микобионта АМ
получение инокулюма для экспериментов и производства.

ПОЛУЧЕНИЕ БИНАРНОЙ ГОРШЕЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ИЗ СПОР

Получение инокулюма АМ гриба

Кювета для исследования физиологии АМ и микоризации растений
(а) – отсек с микоризным растением
(b) – отсек для внесения субстрата
(c) – отсек с растением-реципиентом

Постановка эксперимента для изучения транспорта углерода в микоризной сети (АМ)
«Крестообразный горшок», проникновение корней в гифальный отсек предотвращается сеткой для изучения влияния свободного мицелия на поглощение растениями питательных веществ

МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭКТОМИКОРИЗЫ
изучение морфологии и цитологии
методы идентификации микобионта (морфотипирование, молекулярные методы)
методы количественного учета
картирование
изотопные методы
(физиология)
работа с чистыми
культурами (физиология)
синтез микоризы in vitro и в микрокосмах
молекулярный анализ
структуры ЭМ сообщества

Морфология эктомикоризы

фиксаторы:
р-р Джуэля (2%-ная хромовая к-та – 25 мл, 10%-ный хлорид платины - 2,5 мл, ледяная уксусная к-та - 1мл , дист. вода - 75 мл)
метод Лобанова для фиксации микоризы дуба и сосны:
ацетоформол (50%-ный этанол - 100мл , ледяная уксусная к-та - 7мл , 40%-ный формалин - 7 мл)
хромово-уксуснокислый р-р (хромовый ангидрид - 7 г , ледяная уксусная к-та - 3 г, дист. вода - 100 мл)
красители:
толуидиновый синий – интенсивное окрашивание в синий цвет ядер гриба и клеток корня и в голубой цвет – оболочки и плазмы мицелия; для микоризы березы и дуба
по Иоллесу (сафранин – лихтгрюн) – кл. стенки гиф и плазма гриба окрашиваются в зеленый тон; контуры клеток корня окрашиваются менее интенсивно; ядра – в оттенки красного. Рекомендуется для лиственных и хвойных после любых фиксаторов, в т.ч спирта
Цитология эктомикоризы

Цитология эктомикоризы
структуры:
сеть Гартига
чехол
цистиды
строение гиф
по Фельгену – ядра и клетки корня окрашиваются в красный, а оболочка клеток гриба – в розовый цвет; для микориз хвойных.
хлоразол черный (Chlorazol black E, Direct black 38 C.I. No. 30235)
метиленовый синий , метиленовый зеленый и др. Все окраски для постоянных препаратов в канадском бальзаме.
флуоресцентные красители
фазово-контрастная и электронная микроскопия

Количественный учет эктомикориз
У сеянцев: измерение корневой системы целиком; отношение длин микоризованной части к общей – МИКОРИЗАЦИЯ (%).
Методом пересечения ячеек: измерения под бинокуляром фрагментированных корней.
Для получения более четкой картины корни просветляют 10% водным KOH и окрашивают.
Биомассу экстраматрикального мицелия оценивают по количеству маркеров – хитина, эргостерола, специфичных жирных кислот (PLFA 18 : 2ω6,9 ).
НО: специфичными только для ЭМ мицелиев эти вещества не являются.

Количественный учет эктомикориз

Количественный учет микоризы в фитоценозе
Количественные характеристики микотрофизма, или доли участия немикотрофных и в разной степени микотрофных растений в фитоценозе:
частота встречаемости микотрофных видов в растительном сообществе, в процентах к числу исследованных растений в фитоценозе (V);
2) средняя интенсивность микоризной инфекции, или коэффициент интенсивности микоризной инфекции (Q);
где
сумма значений интенсивности микоризной инфекции у микотрофных ценобионтов; п — число видов в фитоценозе, у которых обнаружена микориза.

Количественный учет микоризы в фитоценозе
3) относительная интенсивность микоризной инфекции, или мико-симбиотический коэффициент фитоценоза (M);
4) микосимбиотический ряд дифференциации (W).
где N — общее количество исследованных видов в фитоценозе
—сумма значений, выражающих интенсивность микоризной инфекции у отдельных микоризных видов фитоценоза.
дает представление о соотношении между немикотрофными, слабо-, средне- и высокомикотрофными растениями (в процентах к общему числу видов растительного сообщества).

Методы идентификации микобионтов микориз
Наблюдение распределения ПТ в лесах
Прослеживание гиф от ПТ к микоризе
Идентификация чистых культур микоризообразователей
Синтез микориз культурой известного гриба
Идентификация ЭМ грибов по микоризам
Данные анализа ДНК

Трудности идентификации микобионта ЭМ:
Выделение морфотипов микоризных окончаний и создание описаний и определителей– проблема до сих пор не решена
Мицелий микоризообразователей нефизиономичен и не обладает признаками, отличающими его от мицелия грибов других эколого-трофических групп
Микобионты почти не растут в культуре на питательных средах (кроме видов Suillus, Laccaria)
Ресинтез микоризы трудоемок
Обнаружение плодовых тел вблизи корневой системы дает только приблизительное представление о симбиозе
Suillus
Laccaria

Методы изучения микоризообразующих грибов
Наблюдение за плодовыми телами
Культуральные исследования мицелия
Молекулярные техники анализа ЭМ сообществ
Lactarius
Pisolithus
Tomentella

ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКОРИЗ
И ЭМ ГРИБОВ: КАРТИРОВАНИЕ
КАРТИРОВАНИЕ КОЛОНИЙ ЭМ ГРИБОВ
МИКРОКАРТИРОВАНИЕ (McMp) ЭКТОМИКОРИЗ (Agerer, 2002)

Простран-ственное распреде-ление
ЭМ грибов: карти-рование ПТ

Чистые культуры эктомикоризных грибов
Дезинфицирующие р-ры:
100 мг сулемы на 1л воды – обрабатывают 2-3 мин; 30%-ная перекись водорода – 5-20 сек.
Выделение культуры:
из плодовых тел
из ризоморф
из микоризных окончаний

Чистые культуры эктомикоризных грибов
модифицированная среда Мелина – Норкранса (MMN)
CaCl2 0,05 г
NaCl 0,025 г
KH2PO4 0,5г.
(NН4)2 PO4 0,25г.
MgSO4*7H2O 0,15г.
FeCl3 (1% р-р) 1,2мл.
тиамин НCl 100г
солодовый экстракт 3г
глюкоза 10г
вода дист. 1л.
Среды для выделения и культивирования:
среда Пахлевски рН 5,4
тартрат аммония (С4H12N2O6) 0,5г/л
KH2PO4 1 г/л
MgSO4*7H2O 0,5 г/л
CaCl2*2 H2O 0,05 г/л
Fe EDTA 0,02 г/л
H3BO3 0,0028 г/л
MnCl2*2 H2O 0,003 г/л
ZnSO4*7H2O 0,0023 г/л
CuCl2*2 H2O 0,00063 г/л
Na2Mo4*2 H2O 0,00027 г/л
мальтоза 5 г/л
глюкоза 20 г/л
тиамин HCl 0,1 г/л
агар 8,0 – 15,0 г/л

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
.
Для подтверждения микоризности необходимо инокулировать растение-хозяин и при подходящих условиях получить микоризу.
Hutchison, 1991: признаки для идентификации культур ЭМ грибов:
способность к использованию тех или иных источников углерода и азота
скорость роста при разных температурах
устойчивость к различным фунгистатичным и токсичным для грибов веществам
полифенол-оксидазная активность
реакции мицелия на красители (диазониум синий В)
культуральная морфология (текстура, скорость роста, окраска, окрашивание среды)
микроморфология (наличие пряжек, форма, толщина, ветвление, окраска и тип роста гиф, появление утолщений на гифах, тяжей)

Схема стерильного синтеза эктомикоризы

Микрокосмы для синтеза
эктомикоризы

Микрокосмы для синтеза эктомикоризы
В микрокосмах возможны эксперименты с внесением определенных веществ или микроорганизмов и оценкой их влияния на формирование и развитие симбиоза

Микрокосм Suillus bovinus + Pinus sylvestris.
Разрастание мицелия на участке внесения органического вещества из лесной подстилки через 40 дн.

Цветная лазерная сканирующая авторадиография микрокосма через 48 ч. после внесения в побеги Betula 14CO2
Меченый С (красное окрашивание) в корнях и мицелии
Микрокосм с торфом
Paxillus involutus + Betula pendula

Методы аксеничных и почвенных культур для синтеза эктомикориз. Аксеничные культуры

Аксеничные культуры

Нестерильные почвенные культуры

Взаимосвязь между сложностью и возможностью контроля экспериментальных систем исследования микориз
Возможность контроля условий
Сложность системы и возможность экстраполяции данных
на природные условия

Микрокосм vs полевые исследования
Микрокосм
Отсутствие природных флуктуаций и экстремальных значений влажности, концентрации пит. в-в
Отсутствие сезонности
Краткие сроки проведения опыта
Ранние стадии цикла развития растения (без репродуктивной фазы)
Редко прослеживается весь цикл развития
Изучение преимущественно короткоживущих травянистых форм
Отсутствие крупных представителей почвенной фауны (черви, личинки насекомых)

Микрокосм vs полевые исследования
Микрокосм
Возможность исследования особенностей микоризы известных видов и генотипов грибов в чистой, моноксеничной и смешанной культуре с различными видами растений-хозяев
Использование в качестве инокулюма спор или фрагментов мицелия (фактически, отображение нарушенных условий обитания)
Однообразие субстрата меняет соотношение ключевых функциональных групп биоты
Опыты с внесением живых культур требует стерилизации почвы, что вызывает серьезные и трудно учитываемые последствия

Микрокосм vs полевые исследования
Полевые исследования
Сложность изучения подземной части сообщества без серьезных нарушений его целостности
Возможность серьезных нарушений изучаемых сообществ ввиду пожаров, атак паразитов и пр.
Проблематичность выявления влияния отдельного фактора
Сложность выделения корневой системы целиком или учета, какая ее часть подвергнута изучению
Невозможность селективной элиминации определенных видов или групп микробиоты, что осложняет оценку их влияния

Подбор почвы, качественно и количественно близкой по составу к природной в изучаемом сообществе
Подбор типа почвы, который может быть подвергнут стерилизации (НМ контроль) без существенного изменения физико-химических свойств
Подбор генотипов симбионтов, присущих изучаемому сообществу и включение симбионтов разных типов микориз для учета взаимодействий между ними
Выбор характерного и широко распространенного типа растительного сообщества
Включение ключевых видов и функциональных групп (напр., для луга или степи: злаки (АМ), осоки (НМ), другие травы (в разной степени восприимчивые к ОМ), бобовые (клубеньковый симбиоз), орхидные (ОМ), кустарнички (АМ, ЭМ, ЭрМ), мхи). Сообщество должно быть реконструировано с учетом фенологии (посев, пересадка и пр.)
Микрокосм: элементы, необходимые для приближения исследования к природным условиям

Представители каждой группы должны быть включены в виде природных генотипов
Включение растительноядных организмов (выедание) с экологически реалистичным разнообразием и количественными характеристиками
Включение изменений сообщества (действия сезонности, засухи, внесение дополнительных элементов питания)
Внесение инокулюма в «природной» форме: мицелиальная сеть для естественных местообитаний, споры и фрагменты мицелия – для нарушенных
Введение основных функциональных групп микробиоты (МО и микрофауны), напр., микофилов и фитопатогенов, со структурой популяций и в количествах, близких к имеющимся в природных почвах
Микрокосм: элементы, необходимые для приближения исследования к природным условиям

«Полуколичественный» метод оценки количества экстраматрикального мицелия ЭМ на разных расстояниях от корня (по Agerer, Raidl, 2004)

Методы исследования свободного мицелия
эктомикориза
арбускулярная микориза
Метод вставочных мембран
модификация метода мембранных фильтров
Целлюлозо-нитратный или целлюлозо-ацетатный мембранный фильтр с размером пор 0.45-0.6 µm помещают в микоризосферу растения-хозяина

Методы исследования свободного мицелия
Затем фильтры с мицелием вынимают, окрашивают трипановым синим для вычисления общей длины гиф (f, g, h) и красителями на белок для установления жизнеспособности мицелия (i, j).
Экстраматрикальный мицелий остается интактным, что делает возможным изучение его морфологии.

Микоризосфера
1904 – Хилтнер ввел термин «ризосфера», наблюдая увеличение численности микроорганизмов в прикорневой зоне
1953 – Торнтон ввел термин «гифосфера» - совокупность микроорганизмов, приуроченных к поверхности гиф
Начало 1970-х – Рамбелли сформулировал понятие о «микоризосфере», т.к. в лесных сообществах взаимодействие большей части древесных корней с почвенной микробиотой опосредовано гифальными чехлами микоризообразующих грибов

Микоризосфера
Методы исследования принадлежат к стандартным методам почвенной микологии, в частности, методам анализа ризосферы.
В пределах микоризосферы иногда, как и в ризосфере, выделяют зоны по мере удаления от микоризной поверхности (микоризоплана, собственно микоризосфера).
Методы: смывы с корней
посевы методом разведений
посевы с фрагментов корней.
Анализ микоризосферной микробиоты чаще всего проводится в микрокосмах.

Молекулярные методы исследования микориз

I Исследование вклада симбиоза в динамику экосистем (новое направление в экологии – молекулярная экология):
1. распределение в почве микоризных грибов (взгляд на подземное сообщество – кто в действительности обитает на корнях)
2. что происходит при нарушении структуры сообществ в результате пожаров, загрязнений и т.п.
3. выявление генотипов грибов и изучение структуры популяций и границ индивида, что у грибов далеко не очевидно.
Применение молекулярно-генетических методов для исследования микориз

Применение молекулярно-генетических методов для исследования микориз
II идентификация чистых культур микоризообразователей
III идентификация микобионтов непосредственно из микоризных окончаний
IV исследование этапов развития микоризы и взаимодействия симбионтов (генетические методы)

Количественно изучать сообщества ЭМ грибов, распространение их в природе.
Оценить видовое разнообразие и роль в сообществе видов ЭМ грибов без ПТ или с гипогейными или малозаметными ПТ
Внедрение молекулярных методов позволило:
Rhizopogon
Gautieria
Tomentella
Cenococcum
+
Picea

Исследовать генотипы грибов и их связь с физиологией микоризы
Исследовать организмы микоризопланы и микоризосферы
Идентифицировать микобионт непосредственно из ЭМ окончаний.
Изучать свободный мицелий микоризных грибов, который очень трудно или невозможно идентифицировать морфологическими или культуральными методами
Внедрение молекулярных методов позволило:

Выделение (экстракция ) ДНК из микоризного окончания
Накопление нужного участка ДНК (ITS-области (спейсеры) р ДНК или гены) методом ПЦР (полимеразной цепной реакции)
Анализ полиморфизма ДНК (RAPD, RFLP и др.)
Секвенирование
Идентификация полученной последовательности путем сравнения с последовательностями, имеющимися в GenBank.
Схема идентификации микобионта ЭМ молекулярными методами:
Наиболее продуктивное использование методов молекулярного анализа – в совокупности с анализом на основании морфологии.

Недостатки молекулярных исследований микориз:
Получаемые данные принципиально несравнимы (методы экстракции ДНК, ПЦР и т.д.)
Эталонные последовательности, с которыми сравнивают результаты, грешат ошибками и неточностями определения.
Получаемые данные о подземной структуре ЭМ сообщества зачастую противоречат результатам, полученным методом картирования, и объяснить это трудно (в подземной части сообщества никак не отражены виды, активно образующие ПТ).
Микоризное окончание может быть устойчивым сообществом двух и более видов грибов, чьи ДНК выделяются совместно.
Методы все еще дорогостоящи, поэтому количество исследуемых проб минимизируется, иногда в ущерб качеству эксперимента

Перспективы молекулярно-генетических исследований микоризообразующих грибов
I Анализ отношений симбионтов на молекулярно-генетическом уровне, выявление природы сигналов, определяющих возникновение симбиоза
Получение мутантов растений с блоком микоризообразования на разных этапах