Моделирование регуляции развития меристемы побега в эмбриогенезе Arabidopsis thaliana

Объект исследования:
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis был первым растением, геном которого был полностью секвенирован. Существует программа, по которой к 2010 году планируется определить функции всех генов этого растения.
Новосибирск, 2008

Меристема побега Arabidopsis thaliana:
Новосибирск, 2008
Апикальная меристема побега (АМП)
с формирующимися листьями

Основные гормоны,
регулирующие рост и развитие растений:
Новосибирск, 2008
Ауксин – основной гормон растений, который регулирует деление клеток и является фактором дифференцировки - Индолилуксусная кислота (ИУК или гетероауксин).
Цитокинин - растительный гормон, производный 6-аминопурина; Основной природный цитокинин – зеатин (его синтетический аналог – кинетин); отвечает за поддержание тотипотентности
6-фурфуриламинопурин
Сверхзадача информационной биологии в области исследований данного объекта: Разработка методов и компьютерного обеспечения, позволяющего воспроизвести развитие данного организма in silico

Новосибирск, 2008
Цель:
Теоретический анализ регуляторных механизмов поддержания тотипотентности и дифференцировки клеток при развитии меристемы побега Arabidopsis thaliana
Задачи:
Разработка методов и программного обеспечения для реконструкции и моделирования регуляторных контуров генных сетей;
Реконструкция генной сети метаболизма ауксина – регулятора поддержания тотипотентности и дифференцировки клеток при развитии меристемы побега;
Разработка математической модели внутриклеточного метаболизма ауксина с учетом генетической регуляции;
Разработка пространственно – распределённой модели с учётом транспорта основных регуляторов, контролирующих развитие меристемы побега;
Анализ разработанных моделей и их биологическая интерпретация.
Цель и задачи исследования:

Модель роли ауксина в эмбриогенезе; Зеленым цветом обозначены места накопления ауксина и ауксинового ответа. Ауксин накапливается в проэмбрионе за счёт PIN7 системы, осуществляя спецификацию апикальную части растения; затем свободная форма ауксина начинает нарабатываться в апексе и транспортироваться обратно.
Накопление и транспорт ауксина:
Новосибирск, 2008
Паттерны распределения и накопления ауксина в побеге и корне;
Зеленым обозначены места накопления ауксина
H. Tanaka et al., 2006
Friml et al., 2003

Химические структуры веществ, обладающих активностью ауксина:
Новосибирск, 2008
Ben L. Pederson, 2007

Метаболизм ауксина:
Новосибирск, 2008
Woodward and Bartel, 2005
Потенциальные пути биосинтеза ауксина в клетке Арабидопсиса.
Пути биосинтеза de novo ИУК из триптофана и его предшественников

Конъюгация ауксина:
Новосибирск, 2008
Потенциальные пути метаболизма ауксина в клетке Арабидопсиса.
Woodward and Bartel, 2005

Структурная модель генной сети метаболизма ауксина*:
Новосибирск, 2008
*-Ananko et al., 2005

*цитоплазма
*ядро
*клеточная мембрана
*пероксисома
*ЭПР
*хлоропласт
*митохондрия
Новосибирск, 2008
Структурная модель генной сети метаболизма ауксина:

Новосибирск, 2008
Структурная модель генной сети метаболизма ауксина:

Новосибирск, 2008
Редуцированная структурная модель генной сети метаболизма ауксина:

MGSgenerator: блок автоматической конвертации формата ГС в формат моделей:
Новосибирск, 2008

MGSmodeller: Компьютерная система для конструирования, расчета и анализа моделей молекулярно-генетических систем:
Новосибирск, 2008

Результаты моделирования процентного содержания различных форм ауксина в клетке меристемы побега:
В клетках побега Арабидопсиса, свободная форма ауксина и его эстерифицированная форма составляют только <1% и 4% от общего пула ауксина, соответственно. Оставшийся пул ауксина (95%) составляют амидные формы ауксина (Park et al., 2001).
Karin Ljung, 2002
Расчёты модели:
Процентное содержание различных форм ауксина (ИУК) в клетке:
По оси y-проценты
По оси x-форма ИУК
Новосибирск, 2008
Exp- экспериментальные данные

Результаты моделирования динамики изменения концентрации ИУК и GH3 белка в клетке
в зависимости от начальной концентрации:
Расчёты модели:
Концентрация ИУК и GH3 белка в клетке в зависимости от начальной концентрации:
По оси y-концентрация ИУК и GH3 белка
По оси x-время расчёта
Ферменты, которые осуществляют реакции конъюгации ИУК с аминокислотами, кодируются белками семейства GH3, которые кодируются ауксин индуцируемыми генами. Эти ферменты входят в суперсемейство люцифераз (Staswick et al., 2002). Также известно, что ауксин быстро и мимолётно индуцирует накапливание, по крайней мере, трёх семейств транскриптов: SMALL AUXIN-UP RNAs (SAURs), GH3-связанные транскрипты и члены семейства AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (Aux/IAA).
Новосибирск, 2008

Результаты моделирования динамики изменения концентрации ИУК-аланин в норме и при мутациях (trp2,trp3):
Расчёты модели качественно совпадают с экспериментальными данными:
Концентрация конъюгата ИУК-аланин в клетке в норме и при мутациях (trp2,trp3):
По оси y-концентрация ИУК-аланин
По оси x-время расчёта
Мутанты арабидопсиса trp3-1 и trp2-1 имеют нарушения в Trp синтазах a and b, соответственно (Last et al., 1991; Radwanski et al., 1996). Мутанты данных типов накапливают содержание амидных форм ауксина (Normanly et al., 1993; Ouyang et al., 2000), несмотря на низкий уровень триптофана (Muller and Weiler, 2000a; Ouyang et al., 2000)…в кукурузе, однако, Trp синтаза a может действовать без b субъединицы для того, чтобы производить индол, который преобразуется в определённые «защитные» вещества (Frey et al., 1997, 2000; Melanson et al., 1997) или, возможно, в ауксин.
Новосибирск, 2008
* - A.W. Woodward and B.Bartel. Auxin: Regulation, Action, and Interaction. Annals of Botany, 95: 707–735, 2005

Эмбриональное развитие
меристемы побега Arabidopsis Thaliana
Область моделирования
Новосибирск, 2008

Разработка пространственно – распределённой модели:
Основные принципы:
Клетки автомата могут обмениваться химическими сигналами. Было выбрана 3 типа сигналов имеющих биологический смысл:
стволовой сигнал (SS);
сигнал дифференцировки (SD);
базальный сигнал (BS);
Все клетки разделены на несколько типов в зависимости от типа продуцируемого ими сигнала, причем клетки могут менять свой тип;
Тип клетки и продолжительность клеточного цикла зависят от локальной концентрации сигналов;
Направления деления зависят от градиентов распределения сигналов.
Новосибирск, 2008
Сердечковидная стадия развития меристемы побега
(Friml et al.,2003)

Типы клеток автомата:
Промеристем - клетки меристемы зародыша. Эти клетки продуцируют SS и находятся в верхней части зародыша. В процессе развития эти клетки переходят в клетки типа Л2меристеми Л3меристем.
Л2меристем - клетки меристемы, находящиеся во втором слое (считая от эпидермального слоя) верхней части зародыша. Эти клетки продуцируют SS.
Л3меристем - клетки, находящиеся на слой ниже клеток типа Л2меристем. Так же продуцируют SS.
Транзитные - клетки, находящиеся вблизи меристемы. Они так же продуцируют низкий SD, но имеют самый высокий темп деления.
Латеральные - клетки этого типа имитируют «дифференцированные» клетки, которые продуцируют SD.
Суспензорные - клетки суспензора. Эти клетки продуцируют BS и располагаются в нижней части зародыша. В модели их всегда две.
Новосибирск, 2008

Type – тип клетки
BS0, SS0, SD0 – значения сигналов продуцируемых данной клеткой.
BS, SS, SD – значения сигналов с учетом влияния всей ткани.
K – отношение стволового сигнала к сигналу дифференцировки, K=SS/SD.
T – продолжительность клеточного цикла, T=T(K).
Tp – возраст клетки считая от последнего деления.
Новосибирск, 2008
Внутренние параметры «клетки» модели:

Новосибирск, 2008
Темпы делений
клеток меристемы побега:
Промеристем
Л2Меристем
Л3Меристем
Транзитные
Латеральные

Взаимодействие «клеток» модели:
Глобальное взаимодействие
Новосибирск, 2008
Суммарное влияние на клетку с координатой (i, j) есть сумма продуцируемых сигналов по всем клеткам ткани с весами экспоненциально убывающими от расстояния между клетками.
n=|i - k| + |j - m|

Stem signal
Differentiation signal
Basal signal
Визуализация модели
клеточного автомата:
Новосибирск, 2008

Результаты моделирования.
Нормальное развитие зародыша:
Новосибирск, 2008

Sharma V.K. and Fletcher J.C. (2003). Maintenance of Shoot and Floral Meristem Cell Proliferation and Fate. PNAS. 100. 11823- 11829.
Aida M., Ishida T., Tasaka M. (1999). Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: Interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 119. 823–831
Результаты моделирования.
Мутантное развитие зародыша:
Новосибирск, 2008
мутация II видам:
Модель: пороговое значение параметра К у Promeristem (меньше)
Организм: clv3-2
мутация I вида:
Модель: чувствительность Promeristem к Signal of Differentiation (больше), чувствительность L2, L3 к Stem Signal (меньше)
Организм: cuc1 cuc2

Анализ чувствительности модели к параметрам транспорта и синтеза SD (сигнала дифференцировки):
В развивающейся АМП
Нормальное развитие
Новосибирск, 2008
Количество клеток
Параметр синтеза сигнала дифференцировки*

Анализ чувствительности модели к параметрам транспорта и синтеза SD (сигнала дифференцировки):
Нормальное развитие
Мутация II типа
Мутация I типа
Влияние параметра транспорта SD (differentiation signal) на эволюцию клеточного автомата (* - значения параметра в относительных единицах).
В развивающейся АМП
Новосибирск, 2008
Параметр транспорта сигнала дифференцировки*
Кол-во клеток

Распределение паттернов ауксина
в развивающейся апикальной меристеме побега:
Иммунная локализация белков PIN1 в эмбрионе: окрашена полярное расположение PIN1 в диком типе (Michniewicz M. et al., 2007)
Распределение относительного максимума ауксина, полученное с помощью модели
Новосибирск, 2008

Распределение паттернов ауксина
в развивающейся апикальной меристеме побега:
Полярная локализация белков PIN1 на более поздней стадии развития (Steinmann T. et al., 1999)
Распределение относительного максимума ауксина, полученное с помощью модели
Новосибирск, 2008

Новосибирск, 2008
Разработана конвейерная технология конструирования математических моделей генных сетей, включающая следующие этапы:
1) автоматическая генерация базы моделей элементарных подсистем генной сети; 2) реконструкции интегральной математической модели генной сети в компьютерной системе MGSmodeller.
Реконструирована структурная модель генной сети метаболизма ауксина в клетке побега Arabidopsis thaliana. Генная сеть содержит 235 молекулярно-генетических подсистем, объединяющих 162 объекта: 62 гена, 56 мРНК и 44 белка. Все молекулярно-генетические процессы распределены по семи компартментам. Логический анализ модели генной сети показал, что она относится к типу систем, поддерживающих внутриклеточный гомеостаз, за счёт наличия в ней отрицательных обратных связей и множественности путей биосинтеза и конъюгации целевого продукта (ауксина). Данный вывод подтверждён численным анализом интегральной математической модели.
Выводы:

Новосибирск, 2008
Автоматически сгенерированная база математических моделей элементарных подсистем генной сети метаболизма ауксина дополнена моделями, описывающими подсистемы транспорта низкомолекулярных веществ между компартментами клетки. Для моделей элементарных подсистем и интегральной модели подобран оптимальный набор значений параметров, позволяющий адекватно вопроизводить экспериментальные данные, в том числе: стационарное состояние генной сети; процентное содержание в клетке свободной формы ауксина, его эстерифицированной и амидных форм (<1% и 4%, 95% от общего пула ауксина соответственно); наработку амидных форм ауксина в мутантах Arabidopsis thaliana trp3-1 и trp2-1, имеющие нарушения в триптофан синтазах α и β.
Компьютерный анализ математической модели показал, что независимо от начальных значений концентраций ауксина и продукта GH3 транскриптов в заданном диапазоне относительных единиц концентрации, происходит быстрая активация ауксином наработки продукта GH3 транскриптов, который ослабляет сигнал ауксина инактивацией ауксина через конъюгацию. Это свидетельствует о быстрых процессах молекулярно-генетической регуляции в ответ на изменение концентрации ауксина в клетке.
Выводы:

Новосибирск, 2008
Разработана пространственно-распределённая математическая модель развития меристемы побега Arabidopsis thaliana. Для пространственно-распределённой модели подобран оптимальный набор значений параметров, позволяющий адекватно воспроизводить экспериментальные данные, в том числе: пространственное распределение паттернов ауксина в процессе развития апикальной меристемы побега; режимы нормального и анормального развития меристемы, соответствующие таким фенотипам как дикий тип и мутантам cuc1 cuc2 и clv3-2. Из модели предсказано отсутствие других фенотипических проявлений в развитии апикальной меристемы побега.
Анализ модели показывает, что развитие меристемы побега Arabidopsis thaliana на ранних этапов достигается на основе взаимодействия минимального набора процессов: ненаправленной диффузии сигнала дифференцировки и анизотропной диффузии базального сигнала. Кроме того, развитие апикальной меристемы побега в основном определяется транспортом сигналов и в меньшей степени, их синтезом.
Выводы: