Обзор методов HLA-типирования

Молекулы HLA
Антигенные свойства молекул HLA определяются третичной структурой белковых цепей, экспрессированных на поверхности клеток
Третичная структура, сформированная преимущественно водородными связями между эпитопами белковой цепи, определяется аминокислотной последовательностью этого белка
Аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью ДНК

Молекулы HLA
Иммуногенность
Аминокислотная последовательность белка
Нуклеотидная последовательность ДНК

Молекулы HLA
Иммуногенность
Аминокислотная последовательность белка
Нуклеотидная последовательность ДНК

Молекулы HLA
Иммуногенность
Аминокислотная последовательность белка
Нуклеотидная последовательность ДНК

Молекулы HLA
Изменение иммуногенности HLA
Замена аминокислоты
Замена 1-го нуклеотида

Молекулы HLA
Изменение иммуногенности HLA
Замена аминокислоты
Замена 1-го нуклеотида

Задача HLA-типирования – охарактеризовать специфичность молекулы HLA
Наиболее точный способ HLA-типирования – получение представления о последовательности нуклеотидов ДНК, кодирующих молекулу белка
Молекулы HLA

Exon 2
Exon 3
Exon 2
Exon 2
HLA class I
HLA class II
Вариабельные участки HLA-молекул
Стабильные участки HLA-молекул
Вариабельные участки HLA-молекул кодируются
HLA class I – Экзоном 2 и Экзоном 3
HLA class II – Экзоном 2
Молекулы HLA

Лимфоцит
м-РНК
ДНК
Аминокислотная последовательность
Молекулы HLA – процесс создания
Хромосома 6
Ядро клетки

Лимфоцит
м-РНК
ДНК
Аминокислотная последовательность
Молекулы HLA – процесс создания
Хромосома 6
Транскрипция
Трансляция
Процессинг
Экспонирование
1
2
3
4

Лимфоцит
м-РНК
ДНК
Аминокислотная последовательность
ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
- третичная структура
белковой молекулы
Типирование молекул HLA
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
- последовательность
нуклеотидов геномной
ДНК

Лимфоцит
м-РНК
ДНК
Аминокислотная последовательность
ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
- третичная структура
белковой молекулы
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
- последовательность
нуклеотидов геномной ДНК
Серологический метод
(реакция АГ-АТ)
Молекулярно-генетические методы (принцип комплементарности цепей)
Типирование молекул HLA

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
1. Выделение популяции Т-лимфоцитов
- центрифугирование
- иммуномагнитная сепарация
2. Лимфоцитотоксический тест
1
2

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
Серологическое типирование необходимо провести в течение 1 рабочего дня с момента взятия крови, так как лимфоциты разрушаются.
Хранение образцов крови невозможно.

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
Метод субъективен, нет возможности документации изображения результатов комплемент-зависимого лизиса лимфоцитов, требует работы персонала с микроскопом.
Метод позволяет определить реальное наличие молекулы на поверхности клетки, является способом выявления т.н. «нулевых» (не экспрессированных) аллелей.
Метод способен типировать антигены class I – локусы А, В, С на низком разрешающем уровне, не способен типировать антигены class II – локусы DR, DQ, DP. Результатов такого типирования недостаточно для осуществления трансплантации.

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ
Существует возможность фенотипирования с помощью проточной цитометрии. Результаты по качеству аналогичны серологическому типированию в лимфоцитотоксическом тесте, по стоимости гораздо дороже.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
1. Выделение ДНК из цельной крови
(источник – ядросодержащие форменные элементы)
- ручные способы (спиртовая преципитация,
колоночное выделение, магнитная сепарация)
- автоматизированные способы (выделение на
процессорах магнитных частиц)
2. Молекулярно-генетическое типирование
- SSP (Sequence Specific Primers)
- SSO (Sequence Specific Oligonucleotides)
- SBT (Sequencing Based Typing)

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
Взятие венозной крови
Выделение ДНК
Хранение крови, а лучше – выделенной ДНК при -80оС несколько лет
SSP
SBT
SSO
1
2
2
2

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
Выделение ДНК возможно всего из 150 мкл венозной крови
1. Выделение ДНК: однотипно для всех молекулярно-генетических методик
Кровь может храниться 2 недели при +2-8оС или годами при -20оС
Возможность автоматизации выделения ДНК – 96 образцов в течение 1 часа (768 образцов за рабочий день)

SSP (sequence specific primers)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
Амплификация
ДНК
На дно лунок планшеты закреплены смеси праймеров, комплементарных определенным специфичностям HLA
Полимераза, нуклеотиды, Mg2+
Электрофорез
Фотодокументация
Интерпретация по таблице смесей праймеров
+
SSP

Polymerase
Polymerase
Polymerase
Polymerase
Polymerase
5‘
5‘
3‘
3‘
3‘Primer (reverse primer)
5‘Primer (forward primer)
SSP (sequence specific primers)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SSP

5‘
5‘
3‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
5‘
3‘
ПЦР прогрессирует экспоненциально
(количество копий = N x 2n)
начав с 2 молекул ДНК, после 25 циклов ПЦР
получаются 67’108’864 копий
1.Цикл
2.Цикл
3. Цикл
Цикл:
Денатурация (96°C)
Отжиг (65°C)
Элонгация (72°C)
dNTPs
SSP (sequence specific primers)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SSP

Метод документируем, оборудование универсальное (для любого ПЦР-анализа), система открытая – в РФ поставляются наборы 5 производителей.
Метод позволяет генотипировать HLA как по class I, так и по class II: локусы A*, B*, C*, DR*, DQ*, DP* как на низком, так и на высоком разрешении в течение 3-х часов.
Производительность ограничена количеством амплификаторов: на 1-ом амплификаторе сотрудник выполняет 4 типирования в течение рабочего дня.
SSP (sequence specific primers)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SSP

SSO (sequence specific oligonucleotides)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
ДНК
Амплифицируются не конкретные специфичности, а большие участки ДНК – целые локусы
Полимераза, нуклеотиды, Mg2+
Гибридизация на полистирольных микросферах
+
Гибридизация на стрипах
SSO

Гибридизация крупных «локусных» ампликонов
со специфическими олигонуклеотидами,
нанесенными на микросферы или стрипы.
По принципу комплементарности участки
исследуемой ДНК соединяются с
олигонуклеотидами.
Микросферы оцениваются при помощи
двухцветного лазера, стрипы – в специальном
сканере, выявляющем положительные реакции.
Оценку результатов производит ПО.
SSO (sequence specific oligonucleotides)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SSO

Метод документируем, оборудование специфическое, системы закрытые, невозможно высокоразрешающее типирование, ПО необходимо контролировать.
Метод позволяет генотипировать HLA как по class I, так и по class II: локусы A*, B*, C*, DR*, DQ*, DP* на низком и т.н. «среднем» разрешении.
Производительность – 16 образцов по 3-м локусам в течение 3-х часов.
SSO (sequence specific oligonucleotides)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SSO

SBT (sequencing based typing)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
Амплификация
ДНК
Полимераза, праймер к необходимому экзону, dNTP, ddNTP, Mg2+
Капиллярный электрофорез
Интерпретация
+
SBT

dNTP ddNTP
O
OCH2
H
H
H
H
O
H
P
O
O
O-
Base
H
3
5
O
OCH2
H
H
H
H
H
P
O
O
O-
~
Base
H
3
5
Deoxy
Deoxy
Deoxy
Dideoxy
Реакция секвенирования
ddATP = Adenine
ddGTP = Guanine
ddCTP = Cytosine
ddTTP = Thymine
}
ddNTPs
SBT

O
OCH2
H
H
H
H
H
P
O
O
O-
~
Base
O
OCH2
H
H
H
H
OH
H
P
O
O-
P
O
O
O-
~
-O
O-
P
O
~
Base
H
O
3
5
5
3
ddNTP
dNTP
DNA
SBT

SBT (sequencing based typing)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SBT

Только с помощью SBT возможно определение новых аллелей (в мире ежегодно открываются порядка 500 новых аллелей – успеть создать новые праймеры к ним для SSP и олигонуклеотиды для SSO невозможно).
Метод позволяет генотипировать HLA как по class I, так и по class II: локусы A*, B*, C*, DR*, DQ*, DP* на низком и максимально высоком разрешении (понуклеотидная последовательность), необходимом для неродственной трансплантации ГСК.
Производительность зависит от количества капилляров и выбранной стратегии типирования, до 1000 секвенирований в день.
SBT (sequencing based typing)
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ
SBT

Exon 2
Exon 3
Exon 2
Exon 2
Exon 2 + 3 для HLA class I
Exon 2 (β-chain) для class II
Аллели, которые имеют одинаковую последовательность нуклеотидов в этих экзонах будут иметь одинаковое влияние на исход трансплантации
class I
class II
SBT

ОГРАНИЧЕНИЕ МЕТОДОВ
Искусство производства наборов SSP – создание многообразия высокоспецифичных праймеров; наборов SSO – специфичных олигонуклеотидов, которые будут комплементарны только определенному участку ДНК
SSO/SSP
Но, так как праймер или олигонуклеотид – это короткий фрагмент НК, прикрепляющийся к начальной части гена, полимеризация или гибридизация одинаково активно будет происходить даже в том случае, если в кодирующей части имеется мутация! А так как оценка результата основана на выявлении только количества продукта в геле, на микросферах, или на стрипах, а не его качества, получение точной информации о нуклеотидной последовательности методами SSP и SSO невозможно.

Искусство типирования методом SBT заключается в технической точности выполнения исследования для получения «чистого» ссиквенса, который отображает всю нуклеотидную последовательность ДНК, даже точечную мутацию!
SBT
Методом секвенирования – SBT, являющимся в настоящее время стандартом в решении вопроса о возможности неродственной трансплантации ГСК, определяется не количество продукта амплификации, а его качество – понуклеотидная последовательность цепи ДНК.

SBT

Стоимость
SBT
SSO
SSP
Serology
>
>
>