Свободные радикалы. Образование и метаболизм

Что такое свободный радикал ?
Свободный радикал - это молекулярная частица, у которой на внешней оболочке имеется хотя бы один неспаренный электрон.
Радикал может образоваться из молекулы при ее окислении, например при отрыве атома водорода (т.е. электрона и протона)

Электронная структура некоторых радикалов
O2 + e¯ → ·OO¯
·OO¯ + H+ → ·OOH

Биохимические
Маркеры
Диеновая коньюгация
Ингибиторный анализ
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)
Прямое обнаружение радикалов
Метод спиновых ловушек
Хемилюминесценция
Собственная
Активированная
Методы изучения реакций с участием свободных радикалов

Хемилюминесценция при цепном (перекисном) окислении липидов

Цепное окисление липидов
→ LOO● + InH → LOOH + In● → Обрыв цепи
Цепному окислению подвергаются жирные кислоты, углеводородные цепи которых содержат двойные связи. Окисление начинается с отрыва атома водорода в метиленовой группе рядом с двойной связью:
— CH2 — CH = CH —
Обозначим эту группу как LH.

Реакции цепного окисления липидов

ХЛ и [O2] (отн. ед.)
Время инкубации, мин
3
6
9
12
15
18
Коррелляция между цепным окислением липидов и ХЛ в суспензии митохондрий к которым добавили ионы Fe2+.

Коррелляция между образованием продукта пероксидации (МДА) и ХЛ в суспензии митохондрий.
100
50
0
18
21
24
27
30
Хемилюминесценция
Условные единицы
Время инкубации, мин

Fig. 8
(1971)

Реакции, ответственные за хемилюминесценцию

Вспышка свечения при взаимодействии
Fe2+ с окисленными липидами

Измерение ХЛ – прямой метод определения радикалов LOO· в биохимических системах
LOO· + LOO· → LOH + L=O* + 1O2
L=O* → L=O + фотон
1O2 → 3O2 + фотон
Недостатки ХЛ метода:
Свечение очень слабое.
Свечение неспецифическое.
В результате:
Неизвестно, измеряем ли мы нужные нам процессы или же побочные реакции.

Хемилюминесценция при образовании активных форм кислорода

Основоположники
Robert Allan. Открыл ХЛ нейтрофилов в 1971 году.
A.U. Khan. Открыл ХЛ при реакции гипохлорита с H2O2 в 1970 г.
Юрий Владимиров (1959). Сверхслабое свечение животных тканей.
Берлин 1997

Супероксидный радикал
Встретив чужеродную частицу, например, бактерию, фагоцит прикрепляется к ней и начинает выделять активные формы кислорода, первая из которых - супероксидный радикал.
НАДФН + 2О2 → НАДФ+ + 2(•О2¯)
Реакция катализируется ферментным комплексом —НАДФН оксидазой, который встроен в цитоплазматическую мембрану.

Метаболизм супероксидного радикала
2 ·OO¯ → H2O2 + 3O2 (Супероксиддисмутаза)
2 ·OO¯ → H2O2 + 1O2 (Спонтанно)
1O2 → 3O2 + фотон (1268 нм)
H2O2 → H2O + ½O2 (Каталаза)
H2O2 + Cl¯ → H2O + ClO¯ (Миелопероксидаза)
H2O2 + ·OO¯ + H+ → H2O + ·OH + 1O2
(Реакция Габер-Вейса)
H2O2 + Fe2+ → HO¯ + Fe3+ + ·OH
(Реакция Фентона)
ClO¯ + Fe2+ → Cl¯ + Fe3+ + ·OH
(Реакция Осипова)

Судьба супероксидного радикала и нитроксида

Хемилюминесценция через стадию образования эксимеров кислорода

Активированная ХЛ
1. Химические активаторы
(Sensitizers)

Два типа активаторов ХЛ – CL enhancers

Активировированная ХЛ лейкоцитов
Вспышка ХЛ при добавлении стимула к нейтрофилам.
1- без активатора, 2 – с люминолом.
Число клеток: 1 = 1×106, 2 = 1×104.
Чувтсвительность: 1 = ×20, 2 = ×1.
Yu. A. Vladimirov, S. R. Ribarov, P. G. Bochev, L. C. Benov, and G. I. Klebanov. Gen. Physiol. Biophys. 9 (1):45-54, 1990.
1×104 клеток,
+ люминол
1×106 клеток, без активатора
Люминол

Люминол — реагент на гидроксил-радикал и гипохлорит.
●OO¯
HO●
Luminol-radical
+ фотон

Люцигенин — реагент на супероксид.
сине-зеленая
люминесценция
+ ROOH
или R=O
+ фотон
N
X¯
R
CH3
N
H2
люцигенин
N
X¯
O
CH3
+ HOOH в
щелочной среде

Хемилюминесценция при окислении ксантина
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
1200
1400
1600
1800
2000
2200
Время, с
ХЛ сигнал, мВ
1256 – sucr-TRIS+100 mcL lucigenin+100mcL xantin
1346 – + XO less than 100 mcL
1686 – 100 mcL lucigenin
1804 – 100 mcL lucigenin
1926 – 50 mcL SOD
2036 – off
lucigenin + xantin
XO
lucigenin
lucigenin
SOD

Хемилюминесценция митохондрий

Место образования супероксида в митохондриях
FIG. 8. Scheme illustrating the effects of mitochondrial electron transport inhibition on superoxide generation. Sites of inhibition are indicated with boxes.
J. Duranteau‡ N. S. C., A. Kulisz, Z. Shao, and P.T. Schumacker, Intracellular Signaling by Reactive Oxygen Species during Hypoxia in Cardiomyocytes, JBC, 273(19):11619-11624 (1998).

Активированная ХЛ
2. Физические активаторы
(Sensitizers)

Активированная ХЛ. Физические активаторы.
Квантовый выход ХЛ (ηХЛ):
Многие химические реакции сопровождаются очень слабым свечением. Почему оно слабое?
≈ 10– 4
≈ 10– 4
≈ 10– 8

Хинолизин кумарины — физические активаторы

Механизм физической активации ХЛ
>C=O*
Липидные радикалы
φ = 0.1 – 1.0

Lipid peroxidation
Fenton’s reaction
Concentration of C-525, M
Cemiluminescence
Активация ХЛ кумарином C-525
10–9
10–8
10–7
10–6
10–5
10–4
1
10
100
1000