Влияние возраста пациентов на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани

Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (МСК-ЖТ) стимулируют рост кровеносных сосудов
Стабилизация новообразованных сосудов
МСК-ЖТ
uPA, плазмин, матриксные металлопротеиназы
Продукция ангиогенных факторов роста
МСК-ЖТ
VEGF, HGF, bFGF, Angpt1 и др.

Старение МСК
Генетические и эпигенетические нарушения
МСК молодого донора
МСК пожилого донора
Снижение числа и/или способности к самообновлению и регенеративного потенциала МСК
Возраст-ассоциированные заболевания
Клеточное старение
Функциональные нарушения Апоптоз
Укорочение теломер; ↓ теломеразной активности; ↑оксидативного стресса; ↑повреждения ДНК; ↑ p16/INK4a, p19/ARF, р21, p53
Клеточная терапия аутологичными клетками
El-Ftesi et al., 2009; Zhu et al., 2009; Huang et al., 2010; Madonna et al., 2011

Цель работы - оценить влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани пациентов без кардиологических заболеваний и больных ишемической болезнью сердца.
Задачи
Сравнить иммунофенотип, пролиферативную активность и накопление маркеров старения в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ишемической болезнью сердца (ИБС) и без нее.
Оценить содержание ангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтина-1, ангиогенина и тромбоспондина-1) в кондиционированной среде и ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.
Проанализировать профиль экспрессии генов, кодирующих факторы, которые участвуют в регуляции ангиогенеза, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста с ИБС и без нее.

Пациенты
1. Пациенты без ИБС (n=31):
2-12 лет (n=4, средний возраст 7,3±5,4 лет)
35-55 лет (n=14, средний возраст 42,3±7,1 года)
Старше 60 лет (n=13, средний возраст 66,2±6,8 лет)
2. Пациенты с ИБС (n=31):
44-48 лет (n=6, средний возраст 46,0±1,67 лет)
52-58 лет (n=10, средний возраст 55,4±1,9 лет)
Старше 60 лет (n=15, средний возраст 68,9±4,2 лет)

Морфология и иммунофенотип МСК-ЖТ не различаются у пациентов разного возраста
CD73(>85%), CD90 (>95%), CD105 (>95%), CD14 (<10%), CD34(<5%), CD45 (<2%), CD79 (<10%)
PDGFRB (>80%), NG2 (>95%)
Пациент К., 2,5 года
Пациент Д., 61 год

С возрастом снижается доля активно пролиферирующих клеток и длина теломер в МСК-ЖТ
*
Median (25%-75%)
*p=0,07
Доля клеток, поделившихся более 10 раз за 5 дней
Возраст пациентов
r = -0,47, p=0,03
r = -0,6, p=0,006
Пациенты без ИБС
Пациенты с ИБС
r=0,8, p=0,006
*p=0,01

Ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижается с возрастом
Пациенты без ИБС
Пациенты с ИБС
Пациент К., 2,5 года
Пациентка М., 71 год
Пациент Н., 44 года
Пациент Г., 70 лет
*
Median (25%-75%)
*p=0,056
r=-0,68, p=0,01
Median (25%-75%)
*p=0,041
*
r=-0,53, p=0,03
Корреляция с длиной теломер в МСК-ЖТ
r=0,49, p=0,01

Вклад VEGF в ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ снижается в клетках с укороченными теломерами
Корреляция между степенью подавления с помощью блокирующих VEGF антител (%) и длиной теломер в МСК-ЖТ r=0,46, p=0,09
Кондиционированная среда от МСК-ЖТ
Median (25%-75%)

Содержание проангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ снижается с возрастом: пациенты без ИБС
Содержание белка в кондиционированной среде от МСК-ЖТ, нг/млн.клеток
Возраст пациентов
r=-0,42, p=0,02
VEGF
Ангиогенин
r=-0,59, p=0,01
PlGF
r=-0,38, p=0,11
Ангиопоэтин-1
HGF
r=-0,59, p=0,03
Корреляция с длиной теломер в МСК-ЖТ
r=0,49, p=0,06
r=-0,66, p=0,005
Корреляция с ангиогенной активностью суммарных продуктов секреции
r=0,66, p=0,05

Содержание проангиогенных факторов роста в кондиционированной среде от МСК-ЖТ снижается с возрастом: пациенты с ИБС
Содержание белка в кондиционированной среде от МСК-ЖТ, нг/млн.клеток
Возраст пациентов
VEGF
Ангиогенин
PlGF
r=-0,37, p=0,09
r=-0,72, p=0,001
r=-0,59, p=0,004
Ангиопоэтин-1
HGF
Корреляция с длиной теломер в МСК-ЖТ
r=0,71, p=0,001
r=-0,44, p=0,07
r=-0,40, p=0,06
Корреляция с ангиогенной активностью суммарных продуктов секреции
r=0,79, p=0,004

Содержание мРНК генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ пациентов разного возраста
PlGF
Пациенты без ИБС
Пациенты с ИБС
Median (25%-75%)
*p=0,076
*
*p=0,1
Median (25%-75%)
*p=0,05
*
HGF

С возрастом происходит активация системы урокиназы в МСК-ЖТ, особенно в группе кардиологических больных
uPA
uPAR
PAI-1
r=0,46, p=0,001
r=0,47, p=0,001
Median (25%-75%)
*p=0,02 **p=0,07
**
Median (25%-75%)
*p=0,01
*
*
Median (25%-75%)
*p=0,03
*

С возрастом происходит активация системы урокиназы и металлопротеиназ в МСК-ЖТ
Экспрессия uPAR на поверхности МСК-ЖТ увеличивается с возрастом
В МСК-ЖТ пожилых пациентов повышается содержание и активность ММП-2 и ММП-9
Пациентка М., 71 год
Пациентка П., 36 лет
Median (25%-75%)
*p<0,05
*
*
r=0,65, p=0,01
А
Б
В
А – пациент К., 2,5 года
Б – пациент П., 52 года
В – пациентка Д., 73 года

Активация системы uPA, матриксных металлопротеиназ
МСК-ЖТ пожилого пациента
Заключение
МСК-ЖТ молодого пациента
Гипоксическое прекондицинирование
Введение генетических конструкций
Накопление маркеров старения
uPA, плазмин, ММП

Благодарности
Моим соавторам Джояшвили Н.А., Старостиной Е.Е.
Моим научным руководителям Парфеновой Елене Викторовне и Калининой Наталье Игоревне
Коллективу кафедры биохимии и молекулярной медицины ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова

Спасибо за внимание!

Критерии исключения (общие)
наличие аутоиммунной патологии;
наличие злокачественных новообразований, в том числе в анамнезе;
наличие острых или хронических воспалительных заболеваний;
сахарный диабет в фазе декомпенсации;
длительная гормональная или антибиотикотерапия;
анемия (гемоглобин < 10 г/дл) и гематологические заболевания;
острые нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговая травма в предшествующие 12 месяцев.

Специальные критерии исключения (пациенты без ИБС)
наличие сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда (ИМ) или миокардита в анамнезе;
клинические признаки стенокардии;
клинические признаки сердечной недостаточности;
нарушения ритма сердца, такие как пароксизмальная или постоянная форма мерцательной аритмии, частая желудочковая экстрасистолия, пароксизмальная желудочковая тахикардия, блокада левой ножки пучка Гиса;
выраженные гиперлипидемии.

Дифференцировка МСК-ЖТ
Пациентка П., 36 лет
Пациентка Г., 63 года