Методы молекулярно-генетической диагностики

Индустрия генетического тестирования
2019: 13 billion USD
CAGR 2020-2026: 12%

В конечном итоге получается 2n молекул ДНК, где n – количество циклов.
Все этапы от выделения ДНК до получения результатов занимают 2-3 часа.
Длина продукта реакции составляет от 50 – 20000 п.о.
Цена реакции крайне мала.

Полимеразная цепная реакция
Маркер длин ДНК
ПК
Образец – Норма
ОК
Образец – Делеция

ПЦР в реальном времени
Интеркалирующий краситель
Флуоресцентные зонды
Длина продукта реакции составляет от 75 – 200 п.о.
5´–3´ экзонуклеазная активность

ПЦР в реальном времени
Определение однонуклеотидных полиморфизмов
AA
AB
BB

Секвенирование по Сэнгеру
Золотой стандарт
Метод «флуоресцентно-меченых терминаторов»
ддНТФ
дНТФ

3130/3130xL
4/16 капилляров
SeqStudio
4 капилляра
3500/3500xL
8/16 капилляров
Секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование по Сэнгеру
Автоматический капиллярный электрофорез

Секвенирование по Сэнгеру
Вариант chr7:103159789 C>T, RELN выявлена в гомозиготной форме

Секвенирование по Сэнгеру
chrX:70444013 CT>C, GJB1 в гетерозиготной форме
chr12:112915524 A>G, PTPN11 в гетерозиготной форме

Секвенирование по Сэнгеру
Этапы подготовки образцов:
Выделение ДНК – 1 час
Подбор праймеров – 1 час
Синтез праймеров – 2-4 дня
Подбор оптимальной температуры отжига – 1-3 часа
Амплификация необходимого фрагмента и его очистка – 2 часа
Амплификация перед секвенированием с дидезоксинуклеотидами и секвенирование – 24 часа

Секвенирование по Сэнгеру
Проблемы:
Сложность при прохождение гомополимерных последовательностей

Секвенирование по Сэнгеру
Аллель специфичные праймеры - при попадании однонуклеотидного полиморфизма в 3’ область праймера

Мультиплексная амплификация лигаз-связанных проб
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
Денатурация (минуты)
Гибридизация (16-20 часов)
Лигирование (20 минут)
ПЦР (1,5 часа)
Фрагментный анализ (2 часа)

Мультиплексная амплификация лигаз-связанных проб
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

Плюсы:
Позволяет одновременно детектировать большое количество мутаций или наличие/отсутствие определенных участков ДНК (до 50) (SNP, делеции, дупликации, число копий генов, анализ метилирования, анеуплоидии)
Позволяет работать с деградировавшей ДНК
Низкая стоимость реакции
Минусы:
Необходимо иметь коммерческие готовые наборы
Cложность и длительность в разработке
Нет возможности определять сбалансированные транслокации
Мультиплексная амплификация лигаз-связанных проб
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

Методы анализа длины тринуклеотидных повторов
Основным методом является ПЦР-анализ полиморфных повторов с последующей визуализацией продуктов амплификации. ПЦР проводят с использованием праймеров, которые фланкируют область повтора.
Далее следует либо электрофорез, либо фрагментный анализ.

Методы анализа длины тринуклеотидных повторов
Фрагментный анализ образцов пациента с Синдромом Мартина — Белла

Полногеномные методы исследования

Выделение геномной ДНК
Фрагментация ДНК
Лигирование адаптеров
ПЦР
Полногеномное секвенирование
Обогащение
Таргетное секвенирование
Фрагментация
Окрашивание - мечение
Гибридизация на чипах
Промывка, мечение
Сканирование
ХМА
NGS
Общий принцип подготовки библиотек

Лизис клеток
Разделение фаз ц/ф
Экстракция
Очень важный этап!
От 30 минут до 2 суток
Очень важно выделить качественную ДНК
Необходимо предоставлять биологический материал
Обязательно взаимодействие с лабораторией-исполнителем при предоставлении ДНК
A260/280 = 1,8
[C]: от 50 нг/мкл (Qubit)
V: от 20 мкл
Выделение нуклеионвых кислот

Фрагментация ДНК
Лигирование адаптеров
ПЦР
Очень важный этап!
Необходимо получить смесь фрагментов ДНК в определенном диапазоне длин (оценить на форезе)
Больше всего ошибок на стадии фрагментации
Высокопроизводительное секвенирование

Высокопроизводительное секвенирование
Секвенируем то, что хотим проанализировать. Обогащаем смесь!

Высокопроизводительное секвенирование

20 000 генов
Экзом
Генные панели
Секвенирование по Сэнгеру
5 – 500 генов
1 ген
Многим пациентам молекулярный диагноз не может быть поставлен другим способом в разумные сроки и при разумных затратах.
Причины: генетическая гетерогенность, отсутствие частых мутаций, крупные гены.

Высокопроизводительное секвенирование

Illumina:
Точность сопоставима с секвенированием по Сэнгеру, 0.1%
Очень высокая производительность
Низкая стоимость на нуклеотид
Парные прочтения
Дорогие приборы и реактивы
Долгий процесс секвенирования
Высокопроизводительное секвенирование
Life Technologies:
Быстрый сиквенс
Высокая производительность
Длина прочтений может достигать 400 п.н.
Гомополимеры
Точность 1%
Нет парных прочтений
Одна из причин ограничений метода – прочтения 150-400 п.н.

Повторы
Покрытие <10x
Сбалансированные транслокации, инверсии
То, что не покрыто панелью
CNV
Высокопроизводительное секвенирование

NGS: почему так долго?!
А потом секвенирование 1-2 суток…
…обработка данных 1-2 суток…
От получения биоматериала до готовых к анализу данных примерно 7-10 дней (если все хорошо)

Секвенировать 1 образец – глупо
Собирается «пул» образцов, каждый из которых баркодируется. Все это смешивается в одну пробирку и секвенируется вместе
Одновременно в лаборатории процессируется огромное количество образцов
Различные контроли качества - QC
Много моментов, на которых что-то может пойти не так…
Высокопроизводительное секвенирование

Обработка данных
Преобразование в формат fastq (x2)
Картирование на референс (fwd. reads)
Картирование на референс (rev. reads)
Преобразование в файл SAM
Сортировка и конверсия в BAM
Маркирование ПЦР-копий среди ридов
Поиск участков инсерций/делеций
Выравнивание вокруг инсерций/делеций
Определение пар прочтений
BQSR: рекалибровка показателей качества
Выявление SNP, инсерций и делеций
Фильтрация мутаций по достоверности
#reads
Perl,
SRA toolkit
BWA
BWA
BWA
Picard
Picard
GATK
GATK
Picard
GATK
GATK
GATK
Список SNP
Популяционные частоты:
«1000 геномов»
ESP6500
Exome Aggregation Consortium (~60 000 чел.)
Функциональная аннотация по всем транскриптам гена (RefSeq)
Предсказание патогенности:
SIFT, PolyPhen2 и др. – для замен аминокислот
Интегрированные показатели (SVM, LR)
Эволюционная консервативность
Обнаружение в качестве соматических мутаций при опухолях (COSMIC)
Клиническая аннотация (ClinVar, HGMD, другие базы)
АННОТАЦИЯ
Алгоритм GATK
best practices

Система Genexus – новое решение от Thermo Fisher Scientific для клиник

НИПТ– метод для оценки риска хромосомной патологии у плода.
Анализ выполняется по ДНК плода, выделенной из крови матери

Методика анализа по cffDNA
НИПС
Panorama

Микроматричный анализ

1 пациент = 1 микроматрица
Нет необходимости в тестировании и подборе химии
Нет маневров для удешевления процесса путем оптимизации
Микроматричный анализ

Clinical diagnosis
Research
Blood
CVS
FFPE
Amnio
Cord blood
Mosaicism
LOH/AOH
CNVs
HD
Tissue
750K
Optima
OncoScan
Triploidy
Origin of aberrations
Maternal cell contamination
Tumor markers
Chromosomal microarray analysis (Thermo Fisher). 11024 samples processed to date
MCA
MR/ID
ASD
Epilepsy
RPL
Ultrasound markers
Cancer
POC
XON

Coverage of clinically important regions in different microarrays
HD
750K
Optima

Comparison of marker distribution In different arrays & platforms
Clinical exome (TS1) – 62 309 markers
WES – 214 115 markers
Cytoscan Optima – 315 000 markers
Cytoscan 750K – 750 436 markers
Cytoscan HD – 2 696 550 markers
Gaps to several million b.p.
del4p; different samples, chr4
п.о.

Сбалансированные хромосомные перестройки (транслокации, инверсии)
Точковые мутации
Болезни экспансии тринуклеотидных повторов
Микроделеции/микродупликации, размер которых меньше разрешающей способности микроматрицы
ХМА: Ограничения

Микроматричный анализ
Новые микроматрицы XON смогут заменить MLPA?

Будущее молекулярного кариотипирования

Технология молекулярной инверсионной пробы (MIP)

Онкоскан
(хромосомный микроматричный анализ)
220 000 snp маркеров
Полногеномный анализ числа копий генов и хромосомных сегментов, а также участков с потерей гетерозиготности
900 генов, ассоциированных с развитием опухоли на материале одного образца
Анализ может проводиться на образцах с сильно деградированной ДНК
Для анализа требуется всего 80 нг ДНК
74 мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, IDH1, IDH2, PTEN, TP53, PIK3CA – чувствительность 20%

Научная работа
Научный сервис для различных государственных и коммерческих учреждений
Разработка проекта эксперимента, его выполнение, анализ данных, консультации на всех этапах
Кошкин Филипп Александрович [e-mail]

СЕСАНА – официальный поставщик оборудования и реагентов для исследований в области молекулярной биологии и генетики
[e-mail]

Геномед – первый OEM-партнер Thermo Fisher Scientific в России