Разработка нового метода иммунофлуоресцентной детекции бактериальных антигенов

●Актуальность: в современном мире существует огромное разнообразие патогенных микроорганизмов, вирусов и прионов, представляющих опасность для живых организмов. Патогенные микробы способны преодолевать сопротивляемость организма и проявлять токсическое действие. Одни патогенные агенты вызывают отравление организма выделяемыми ими в процессе жизнедеятельности экзотоксинами, другие — освобождают токсины при разрушении своих тел.
●Значение диагностики инфекционных заболеваний:
- Необходимость срочной постановки диагноза, для соответствующей
рациональной, своевременной и эффективной терапии.
- Проведение противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Цель работы - разработка нового метода повышения специфичности теста для индикации бактериальных антигенов.

Задачи работы:
Теоретический анализ факторов, влияющих на специфичность и разработка механизма, позволяющего повысить чувствительность и специфичность методов иммунотипирования бактерий.
Разработка модели нового иммунохимического метода типирования бактерий.
Проверка корректности модели и поиск оптимальных условий реакции на примере (Salmonella infantis, Salmonella enteritidis, Escherichia coli).

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний
Иммунохимические методы типирования бактерий
Прямые методы определения реакции антиген-антитело
Иммуносенсоры
Пассивная агглютинация
Индикаторные методы, основанные на использовании меток
Новый метод иммунофлюоресцентной детекции бактериальных антигенов

Строение антитела.

Реакция антиген-антитело
Этапы реакции:
1.Достаточно быстрое взаимодействие антигенной детерминанты с комплементарной областью иммуноглобулина. В результате этой реакции образуется иммунный комплекс антиген-антитело;
2.Медленное возникновение мультиполярных комплексов, включающих в себя огромное число молекул антигена и антител.

Реакция коагглютинация (РКА)
Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка.

Бактерии Escherichia coli окрашенные акридиновым оранжевым. Фото сделано с помощью люминесцентного микроскопа.
Флуоресцентные методы – совокупность иммунохимических методик, основанных на использовании индикаторных антигенов или антител, полученных с помощью введения в их состав флуоресцентных меток.

1.Escherichia coli
2.Salmonella infantis
3.Salmonella enteritidis
1
2
3
Бактерии, окрашенные акридиновым оранжевым.
Фотографии сделаны с помощью люминесцентного микроскопа.

Новый иммунохимический метод типирования бактерий
Меченый антиген
Антитело
Иммобилизированные бактерии
Схема реакции

Иммобилизировать исследуемые бактерий на предметном стекле (фото 1);
Нанести на стекло соответствующую сыворотки;
Инкубировать в течение 20 минут (фото 2,3);
Приготовить меченые бактерий (антигенов) (фото 4,5,6);
Нанести меченые антигены на предметное стекло;
Инкубировать в течение 20 минут;
Промыть препарат в промывочном буфере;
Сполоснуть водой;
Рассмотреть под люминесцентным микроскопом.
Порядок проведения нового иммунохимического метода:

Фото 1
Фото 2
Фото 3
Рис.4
Фото 5
Фото 4
Фото 6

Escherichia coli+ser-E.coli-ag-infantis

Salmonella infantis + ser-infantis + ag-infantis

Salmonella
Escherichia coli

Выводы:
Сравнение результатов эксперимента и изученной информации позволяет сказать, что реакции, которые являются значимыми в постановке метода и являются основополагающими факторами, влияющими на чувствительность и специфичность методов иммунодиагностики.
Была разработана модель нового иммунохимического метода иммунотипирования бактерий.
На примере бактерий Salmonella infantis, Salmonella enteritidis, Escherichia coli была проведена проверка корректности модели и поиск оптимальных условий.

Преимущества метода:
Достаточно высокая чувствительность.
Экономичность
Простота постановки
Точность
Быстрота постановки.
Экономическая эффективность.