Современные методы морфологической диагностики

Иммунная система — совокупность органов, тканей и клеток, обеспечивающих клеточно - генетическое постоянство организма.
Принципы поддержания структурного постоянства основываются на распознавании «своего- чужого» и во многом обусловлены системой генов и гликопротеинов — продуктов их экспрессии — главный комплекс гистососовместимости (МНС — majоr histocompatibility complеx).
В многих случаях происходит распознавание изменённого «своего», что расценивается иммунной системой как «чужое».
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ

Органы системы.
Выделяют центральные (костный мозг, вилочковая железа и лимфоидная ткань кишечника) и
периферические (селезёнка, лимфатические узлы и скопления лимфоидной ткани в собственном слое слизистых оболочек кишечного типа) органы.

а. Центральные органы осуществляют образование и созревание иммунокомпетентных клеток.
б. Периферические органы иммунной системы обеспечивают адекватный иммунный ответ на антигенную стимуляцию — «обработку» Аг,
его распознавание и
клональную пролиферацию лимфоцитов (Аг- зависимая дифференцировка).

Иммунный ответ вызывают Аг (термин предложил Детр- Дойч, 1899).
а. Антигены — вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций (гуморальных, клеточных, состояние иммунологической толерантности, индуцирование иммунологической памяти).
б. Иммуногенность и антигенность. Свойства Аг определяет их иммуногенность способность индуцировать иммунный ответ — и антигенность — способность Аг избирательно реагировать со специфичными к нему АТ или Аг - распознающими рецепторами лимфоцитов.

Эпитоп (антигенная детерминанта) — фрагмент молекулы (молекул) Аг, (локализующийся внутри или на поверхности молекулы).
Индуцирующий иммунный ответ и определяющий его специфичность.
Антигенная детерминанта избирательно реагирует Аг-распознающими рецепторами и/или АТ.
(а) Структура многих Аг- детерминант известна. Например, в полипептидной последовательности эпитопом может быть фрагмент из 7-8 аминокислотных остатков,
но свойство антигенности дополнительно и облигатно определяет пространственная конфигурация фрагмента.

Иммуногистохимия – это методика выявления наличия онкологического процесса в организме посредствам оценки содержания антигенов.
С ее помощью можно не только диагностировать раковое заболевание на ранней стадии, но и спрогнозировать дальнейшее течение.
Используется в качестве диагностики рака и оценки эффективности выбранного метода лечения

Суть и возможности метода
При наличии в организме онкологического процесса, в кровь попадают антигены.
Их наличие указывает на патологию, а конкретный тип на место локализации новообразования.
С его помощью можно более точно поставить диагноз и определиться с эффективностью лечения.

Исследование заключается в выявлении антигенов, что возможно посредствам проведения ряда тестов.
Используются реактивы, в состав которых входят «меченые» антитела. Эти белковые структуры имеют определенный цвет, который придают им специализированные красители.
Антитела способны выискивать антигены и вступать с ними в связи.
Подобная реакция называется «антиген-антитело», когда с помощью меченых клеток удается определить наличие антигенов, указывающих на наличие злокачественного опухолевого процесса.

С помощью иммуногистохимического исследования можно выявить не только наличие онкогенных маркеров, но и
определить некоторые рецепторы к гормонам, что
эффективно при гормонозависящем типе опухоли или прогрессирующих эндокринных заболеваниях.

Результаты исследования показывают:
Гистологическую принадлежность опухоли, что подтверждает или опровергает наличие рака.
Локализацию опухолевого процесса и органы-мишени, которые в дальнейшем пострадают – это позволяет максимально направить все методы лечения на подавление патологического процесса именно в конкретном участке тела.
Возможную методику лечения и резистентность клеток к определенным видам медикаментов.
Врач может прогнозировать, насколько эффективным будет тот или иной препарат для конкретного пациента.
Это минимизирует риски развития побочных воздействий и отсутствие терапевтического эффекта.

(б) Моноклональные АТ специфически распознают собственные Аг -детерминанты и связываются с ними.
Каждое моноклональное АТ распознаёт только одну Аг - детерминанту.
(в) Поликлональные АТ (например, антисыворотки), как правило, распознают несколько Аг - детерминант в составе Аг.
(2) В отечественной практике иммуногенность чаще определяют как специфичность, а
термин «антигенность» больше связан с понятием «чужеродность».

Многообразие понятия «антиген».
Аг разделяют на полные (иммуногенные), всегда проявляющие антигенные свойства, и неполные (гаптены), неиммуногенные.
1. Гаптены обладают антигенностью, но не иммуногенны.
Гаптены могут стать иммунными при связывании с носителем - шлеппером, обладающим собственной иммуногенностью.
Например, хром и никель, связываясь с белками кожи, способны вызвать аллергический контактный дерматит, развивающийся при повторных соприкосновениях кожи с хромированными или никелированными предметами.

а. Простые гаптены представлены дисахарами и простыми органическими соединениями.
б. Комплексные (преципитирующие) гаптены — полипептиды, полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты.
2. Природа Аг.
Аг могут быть белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты в комбинации между собой или липидами.
Наибольшей иммуногенностью обладают белковые Аг, например все бактериальные токсины, вирусная нейраминидаза и гемолизины, сывороточные белки (исключением являются казеин и фибриноген).

Преимуществом иммуногистохимии является точное выявление типа рака и места его локализации (очага).
Выявить это никакими другими сверхточными методиками невозможно.
Именно окрашивание образца биоматериала показывает, какие клетки имеются в опухоли, как они себя ведут, и как будет вести себя при воздействии на них определенных способов лечения.

Показания для иммуногистохимии
Исследование необходимо в следующих ситуациях:
При наличии опухоли, которая подает нечеткие эхо-признаки, что требует установления ее природы.
Если имеются метастазы для выявления мест их локализации, что помогает поставить стадию рака.
Составление прогноза и скорости распространения опухолевого процесса.
При необходимости исследования чувствительности рецепторов к определенным видам гормонов, если у человека имеются нарушения в работе эндокринной системы.
Если врач сомневается в методике проведения выбранного типа медикаментозного лечения или отсутствует какой-либо терапевтический эффект.
Показанием служит выраженный опухолевый процесс в любых частях тела.
Иммуногистохимия показывает степень его злокачественности, возможный прогноз и толерантность к медикаментам.

Долабораторная подготовка образца – получение нужного образца осуществляют с помощью биопсии.
Выбор метода зависит от места локализации опухоли, ее формы и распространенности опухолевого процесса.
Часть иссеченных тканей помещают в раствор формалина, после чего образец передают в лабораторию.
Еще одним преимуществом иммуногистохимии является возможность исследования через определенное время.
Нет необходимости обрабатывать образец сразу, как только произведена биопсия. Образцы хорошо хранятся и показывают результаты не хуже, чем в день их забора.

Подготовка образца к исследованию – биоматериал вводят в парафин, что необходимо для полной фиксации образца.
Из полученных элементов тканей готовят тончайшие срезы, что возможно с помощью высокоточного оборудования.
Чем тоньше срез, тем проще проследить химическую реакцию. Срезы укладывают на специальную панель, на которую в дальнейшем будет наноситься реагент.
Окрашивание срезов посредствам введения антигенов – готовят несколько образцов, на которые воздействуют различными антителами. Полученный результат фиксируют по степени окрашенности конкретного участка среза.
Одновременно можно выявлять до 10 типов антигенов, что позволяет установить точную природу опухоли.

Оценка результатов – по истечению определенного времени (7-10 дней) с помощью высокоточного оборудования оценивают степень окраски образцов, делая заключение.
Все полученные данные вносят в специальный бланк-расшифровку, который помогает при постановке точного диагноза.
Его передают лечащему врачу, после чего подбирается соответствующее лечение.

Иммуногистохимия проходит в 4 этапа
Забор биоматериала осуществляют до начала лечения, чтобы оценить истинное положение вещей.
Если использовались медикаменты, данные результатов будут несколько отличаться от истинных.
Для исследования используют часть биоматериала. Вторая часть может храниться в лаборатории.
Это позволит снизить количество вмешательств в организм, особенно при выборе метода лечения.
Нет необходимости сдавать биопсию повторно, чтобы установить, какой именно медикамент будет эффективен в той или иной ситуации.
Преимущество отдают тем лабораториям, в которых окрашивание образцов осуществляется автоматически.
Минимизация человеческого вмешательства в процесс позволяет получать наиболее точные результаты.

а. Экзогенные Аг подвергаются эндоцитозу и расщеплению в Аг-представляющих клетках;
затем фрагмент Аг, содержащий Аг - детерминанту в комплексе с молекулой класса 11 МНС, транспортируется к плазматической мембране Аг - представляющей клетки,
встраивается в неё и предъявляется СD4+ Т-лимфоцитам.
б. Эндогенные Аг — продукты собственных клеток организма.
Чаще всего это вирусные белки, синтезируемые вирусинфицированными клетками хозяина, и аномальные белки опухолевых клеток.
Их Аг-детерминанты предъявляются СD8+ Т-лимфоцитам в комплексе с молекулой класса I МНС.

3. Гетерогенные Аг. Аг, характеризующиеся наличием общих Аг-детерминант между тканями организмов разных таксономических групп, называют гетерогенными, или перекрестно реагирующими.
а. Аг Форссманна — характерный представитель перекрёстно реагирующих Аг, выявлен в эритроцитах кошек, собак, овец и почке морских свинок.
б. Rh - система эритроцитов.
У человека типичные перекрёстные Аг — Rh -Аг, т.к. их агглютинируют АТ к эритроцитам обезьян.
Известны также общие Аг эритроцитов человека и палочки чумы, вирусов оспы и гриппа.
в. Групповые Аг крови — сильные иммуногены; обнаружены на мембране эритроцитов и других клеток.
Поскольку человек обладает естественными АТ (изогемагглютинины) к групповым Аг крови, последние приобретают свойства сильных трансплантационных Аг.
Поэтому перед трансплантацией и гемотрансфузией необходимо определить группы крови донора и реципиента. Выделяют 4 антигенных фенотипа (группы крови) системы АВО: А, В, АВ и 0. Фенотипические варианты обусловлены различными комбинациями аллелей.
г. Наличие перекрёстных Аг способно блокировать системы, распознающие чужеродные структуры.

Не существует противопоказаний к иммуногистохимии в принципе.
Невозможность исследования обусловлена невозможностью забора биоптата, что возможно при расположении опухоли в глубоких слоях тканей и органов, при внедрении в которые есть риски развития смертельно опасных осложнений. Это касается опухолей головного мозга, внутренних частей органов.

Интерпретация результатов
В ходе проведенного исследования выявляется тип онкогенных клеток и их количество, что в дальнейшем
способствует составлению точного прогноза.
Внимание обращают на показатель Ki-67. Именно этот маркер показывает степень злокачественности процесса.
Если его процентное содержание более 85%, то это указывает на запущенный онкологический процесс с наличием метастазов.

Когда показатель опухолевого процента менее 10%, прогноз благоприятный.
При правильно подобранном комплексном лечении существует 95% вероятность перехода в пожизненную ремиссию с сохранением здоровья.
Чем выше процент онкогенности, тем неблагоприятнее прогноз и меньше шансов на жизнь.

После проведения курса лечения иммуногистохимию производят повторно.
На основании оценки количественного и качественного состава клеток можно прослеживать динамику и эффективность лечения.
Отсутствие терапевтического эффекта может быть поводом для повторного проведения исследования, но в другой лаборатории.

Положительная реакция на МПО
в бластах (М3) (костный мозг).

Положительная реакция на МПО
в нейтрофилах и
отрицательная в бластах
при ОЛЛ (L2)

Положительная реакция на липиды
в нейтрофилах
и отрицательная в лимфоците.

Положительная реакция
на липиды в бластах (М2).

СРОКИ ВЫПОЛНЕНИЯ ИГХ ИССЛЕДОВАНИЯ
В соответствии с п.24 Приказа №179н от 24.03.2016 г. Минздрава России, срок выполнения ИГХ исследования:
с использованием до 5 маркеров включительно – не более 7 рабочих дней,
с использованием более 5 маркеров – не более 15 рабочих дней.

ВОЗМОЖНОСТИ ИГХ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Диагностика:
окончательное (реже промежуточное) установление диагноза опухолевого процесса (различные варианты рака, саркомы мягких тканей, меланома, типирование лимфом и лейкозов),
уточнение степени злокачественности опухоли (напр., нейроэндокринной опухоли), что будет определять прогноз заболевания,
дифференциальная диагностика опухолей и неопухолевых процессов,
определение органной принадлежности метастаза с неизвестной первичной локализацией (применимо не для всех опухолей!),
дифференцирование множественных опухолевых процессов (наличие у пациента 2 и более разных опухолей).
2. Лекарственная чувствительность
рецепторы стероидных гормонов (рецепторы эстрогенов, рецепторы прогестерона, рецепторы андрогенов) – рак молочной железы, рак тела матки (эндометрия), другие опухоли;
белок Her2/neu - рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря; Her2Neu - это рецептор эпидермального фактора роста раковой клетки. Это - ген, который воздействует на мембранные рецепторы клетки, и стимулирует её к усиленному делению. В некоторых опухолях (чаще всего рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка) присутствует гиперэкспрессия (повышенная активность) Her2Neu, что вызывает быстрое деление опухолевой клетки и её повышенную активность. Также снижается эффективность химиотерапии, лучевой терапии, гормональной терапии.
рецепторы соматостатина 2А и 5 типов – нейроэндокринные опухоли (карциноиды);

PD-L1 – немелкоклеточный рак легкого, беспигментная меланома, другие опухоли;
ALK - немелкоклеточный рак легкого;
ROS1 - немелкоклеточный рак легкого;
микросателлитная нестабильность (MSI) – рак толстой кишки, другие опухоли;
индекс пролиферативной активности (Ki-67) – различные виды злокачественных опухолей.

1. Иммуногистохимическое исследование Результаты иммуногистохимического исследования выражаются в баллах: 0-1 означает, что опухоль без гиперэкспрессии Her2neu. 3 означает, что опухоль с гиперэкспрессией Her2neu.
2. Метод FISH (Флуоресцентная гибридизация in situ)
В отличие от иммуногистохимического исследования, при котором определяются белки, при методе FISH определяется наличие генов, кодирующих протеины Her2neu.
В зависимости от их наличия, определяется гиперэкспрессия Her2neu. Определение гиперэкспрессии рецептора Her2neu в опухоли молочной железы является очень важным для дальнейшего назначения лечения.
В современной онкологии гиперэкспрессию Her2neu определяют, чтобы понять, необходимо ли добавление к лечению ингибиторов Her2neu.
Для лечения опухолей с гиперэкспрессией рецептора Her2Neu активно и успешно используются таргетные препараты Трастузумаб (Герцептин), Пертузумаб (Перьета), Трастузумаб-эмтанзин (Кадсила), Бейодайм (Трастузумаб+Пертузумаб).
Эти препараты прицельно блокируют рецепторы Her2neu, тем самым останавливая активный рост опухолевых клеток и повышая их чувствительность к химиопрепаратам.
Добавление таргетной терапии к стандартной химиотерапии при лечении Her2neu позитивных опухолей, серьезно увеличивает общую выживаемость и результат противоопухолевого лечения.
Существует две методики определения наличия у опухоли гена Her2neu

3. Ki-67 Ki-67 - это маркер пролиферативной активности опухолевой клетки.
Данный параметр оценивается в процентах и показывает, сколько процентов опухолевых клеток активно делятся. Если Ki-67 меньше 15%, опухоль считается слабоагрессивной, при показателе Ki-67 от 30 до 50% опухоль считается агрессивной, а при показателе Ki-67 выше 50% опухоль является высокоагрессивной.
Также Ki-67 является фактором прогноза течения опухолевого заболевания и ответа опухоли на химиотерапевтическое лечение. Определяется это простым способом: чем ниже показатель Ki-67, тем хуже опухоль реагирует на химиотерапевтическое лечение.

4. Белок p53 Белок p53 - это транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл.
В быстро делящихся клетках обнаружено увеличение концентрации белка р53 по сравнению с клетками, делящимися медленно, что обусловлено высоким риском их онкогенности.
Белок p53 предотвращает образование злокачественных опухолей в нашем организме.
В норме, антионкоген р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК в здоровой клетке - активируется.
Функция белка р53 состоит в удалении тех клеток, которые являются потенциально онкогенными. Это называется - индуцированный апоптоз, уничтожение потенциально опасной клетки.
При иммуногистохимическом исследовании, повышенное содержание белка p53 обнаруживается в 50% злокачественных клеток, что позволяет им беспрепятственно делиться и избегать апоптоза (уничтожения).
Количество белка p53, определяют в дополнение к показателю Кi67, для того, чтобы понять насколько агрессивна опухоль и определить дальнейшее течение болезни.
Если уровень белка p53 высокий, значит опухоль не агрессивная и не склонна к метастазированию и быстрому росту.
Если же, показатель белка p53 низкий, то значит опухоль агрессивна и склонна к быстрому росту в окружающие ткани и метастазированию.

5. VEGF (Фактор роста эндотелия сосудов) VEGF – это сигнальный белок, вырабатываемый клетками для активного роста новых сосудов в уже существующей сосудистой системе.
Есть несколько видов белка VEGF, и каждый воздействует на определенный рецептор VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor).
Для того чтобы активно делиться, опухоли нужно питание, а для этого нужны сосуды, по которым это питание будет поступать. Именно по этой причине в опухолевых клетках содержится повышенное содержание белка VEGF - для того, чтобы в короткие сроки строить сосудистые сети.
Наличие белка VEGF в опухоли говорит о возможности применения таргетной терапии такими препаратами, как Бевацизумаб (Авастин), Рамуцирумаб (Цирамза), Афлиберцепт (Залтрап). Они перестраивают сосудистую сеть опухоли, тем самым лишая её питания.