Верификация ВИЧ-инфекции: иммуноблот, как подтверждающий тест

Принципы тестирования на ВИЧ
Дотестовое консультирование
Информированное согласие
Послетестовое консультирование
цели:
- Оценить степень риска и ВИЧ-статус
Принять обоснованное решение о тестировании
Повысить настороженность и способность защищать себя и других людей от инфекции

Тестирование на ВИЧ –основной компонент любой стратегии профилактики ВИЧ-инфекции
Анонимное (код больного, фамилия неизвестна, сбор эпид. данных).
«Номинальное» (с указанием имени, сбор эпид. данных).
«Не номинальное» (с указанием кода, в направлении код, но фамилия больного известна врачу, сбор эпид. данных)

ВОЗ. Стратегии тестирования на ВИЧ
Скрининг донорской крови (результаты используются для диагностики)
Эпиднадзор за превалентностью ВИЧ-инфекции (результаты не используются для диагностики)
Диагностика ВИЧ-инфекции

Иммунохимические
- ИФА:
антитела
р24-антиген
- иммуноблот
Методы лабораторной диагностики
ВИЧ-инфекции
Молекулярные - детекция
РНК и ДНК
- вирусная
нагрузка
- генотипирование,
определение
устойчивости

Выявление антител и латентный период (1)
Специфические антитела появляются вскоре после инфицирования, однако точное время их появления зависит от макроорганизма и штаммовых особенностей вируса.
Антитела присутствуют на ранних стадиях инфекции, но их концентрация очень низка – ниже предела чувствительности т/с.

Продолжение (2)
При использовании т/с 1-го поколения антитела обнаруживали через 6-12 недель после инфицирования.
Т/С новых поколений (4-го) обнаруживают антитела через 2-4 недели после инфицирования.
IgM на ранних стадиях определять сложно, предпочтительней IgM+IgG (т/с 3-го поколения)

Сроки появления антител
Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения.
5-9% - через 6 месяцев
0,5 -1% - в более поздние сроки
Наиболее ранний срок обнаружения антител 2 недели.
(Покровский В.В с соавт.)

Иммуноблотт (ИБ)
Принцип метода, применение, значение:
ИБ относится к твердофазному иммунохимическому анализу (См. слайд 10, 11).

Мембрану инкубируют с сывороткой пациента. Если в ней имеются антитела к любому известному антигену ВИЧ, они свяжутся с ними на мембране. Остальные антитела будут удалены при отмывании.
В лунку добавляют связанные с ферментом
анти-ГГ. Фермент находится в комплексе с
антителом. Анти-ГГ свяжутся со всеми
антителами класса IgG, образовавшими
комплексы с антигенами ВИЧ. Все свободные
анти-ГГ отмываются.
Микробиология д-ра Кайзера. Домашняя страница

Добавляют субстрат для фермента, связанного с анти-ГГ. Реакция фермента
с субстратом приводит к видимому изменению цвета. Это свидетельствует
о наличии в сыворотке пациента антител к известным антигенам ВИЧ,
нанесенным на мембрану. Если таких антител в сыворотке нет, связанные
с ферментом анти-ГГ отмываются на предыдущих этапах и цвет при
добавлении субстрата не меняется, поскольку субстрату не с чем
взаимодействовать.
Микробиология д-ра Кайзера. Домашняя страница

Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг дает положительные реакции позже, чем ИФА выявляет сероконверсию; в большинстве случаев положительные результаты в ИБ удается получить к 6-му месяцу.
Необходимо получить положительную реакцию по крайней мере с двумя белками продуктами гена env ВИЧ:
gp160, gp120 и gp41 – продукты гена env;
p55, p24 и p17 – продукты гена gag;
p68, p52 и p34 – продукты гена pol.

Иммуноблот
gp160
gp120
p51
gp41
p31
p24
Интерпретация:
«-» - нет полос
«+» - gp41 + gp120/160
или p24 + gp120/160
«результат неопределенный» -
любые другие варианты
Является
подтверждающим тестом
Используется только
в сочетании с двумя ИФА
p66
p17

Интерпретация результатов (1).
Положительный результат ИФА плюс слабая или сомнительная реакция при иммуноблоттинге (особенно на полосы gag) – признак недавнего заражения.
Слабая реакция на полосы env и выраженная – на полосы pol позволяет предполагать инфекцию, вызванную ВИЧ, не принадлежащим к подтипу B.

GP41 – зона неравномерного окрашивания
Зона gp41 состоит из нескольких полос, соответствующих белкам с молекулярной массой от 39 до 46 кДа
Зона, соответствующая gp41, может выглядеть как одна неравномерно окрашенная полоса
Диффузное распределение белков в данной зоне обусловлено разными электрофоретическими свойствами углеводного компонента гликопротеиновой молекулы
Типичные антитела к gp41 связываются со всеми gp41, фиксированными в данной зоне.
Равномерное окрашивание или наличие отдельных полос в данной зоне может быть обусловлено антителами к невирусным белкам (из культуры клеток, в которых выращивают вирус), также присутствующим на тест-полоске, и интерпретируется как отрицательный результат

Белки ВИЧ-1 и ВИЧ-2, определяемые в ИБ.

Продолжение …
При получении сомнительного результата с антителами к белкам сердевины с антигенами ВИЧ-1 проводится исследование с антигенами ВИЧ-2.
При получении положительного результата выдается заключение о наличии антител к ВИЧ в исследуемом материале.
При получении отрицательного результата(когда нет никаких антител) выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ.

Контроль постановки ИБ
Использовать только лицензированные коммерческие диагностические наборы (по возможности)
Строго следовать инструкциям, прилагаемым к диагностическим наборам
Выполнять процедуры внешнего контроля для обеспечения стабильности качества получаемых результатов
Не использовать контаминированные тест-полоски
Не инкубировать тест-полоски с субстратом слишком долго
Если образец отвечает критериям отказа от проведения исследования, запросить новый образец для исследования
В отчете об исследовании следует указывать всю диагностически значимую информацию

Сравнение чувствительности и специфичности ИФА и ИБ
ИФА является более чувствительным методом по сравнению с ИБ.
ИБ - более специфичным по сравнению с ИФА.
Поэтому положительный результат в ИБ выявляется позже.

Скрининг и верификация ВИЧ-инфекции.

ВОЗ рекомендует
повторное тестирование через 2 недели, 1-6 месяцев. При этом повторную сыворотку и исходную исследуют одновременно в одних условиях.
Иногда неопределенные результаты сохраняются годы и эти лица не являются инфицированными.
Лица на стадии СПИДа могут терять антитела и тоже ИБ становится сомнительным. В этом случае рекомендуется ПЦР и культивирование.

Модифицированный вестерн-блот.
Позволяет дифференцировать инфекции, вызываемые ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
На н/ц мембране находятся вирусные лизаты ВИЧ-1 и синтетический пептид (ВИЧ-2 gp36/41).

Линейный иммунный анализ -альтернатива ИБ
(LIA) – на нитроцеллюлозную полоску наносится рекомбинантный антиген или синтетический полипептид. Электрофорез не производится, при таком использовании «искуственных» антигенов отсутствует контаминация культуральными белками

Дилеммы при диагностике ВИЧ
А) Неопределенные результаты в ИБ;
Б) Минимально положительные результаты неинфицированных лиц.
Д) Невоспроизводимые результаты при сравнении образцов.
Г) Наличие технических ошибок.
Д) Ложноотрицательные результаты (ВИЧ О)
Е) Диагностика новорожденных