Внедрение в работу лабораторий молекулярно-генетических методов

Проблема №1
Внедрение в работу лабораторий молекулярно-генетических методов
для детекции:
Патогрупп эшерихий
Факторов вирулентности (эшерихий)
Трудно культивируемых (кампилобактеров)
Возбудителей вирусных диарей
Механизмов резистентности к АМП

Детекция патогенных микроорганизмов увеличилась в 12 раз !
Данные инфекционной больницы №30, С-Пб

Escherichia coli

Деление E coli, вызывающих ОКИ
1.Энтеропатогенные E coli (EPEC),
2. Энтеротоксигенные E coli (ETEC),
3. Энтерогеморрагические E coli (EHEC),
4. Энтероинвазивные E coli (EIEC),
5. Энтероаггрегативные E coli (EAgEC),
6. Диффузно-адгерентные E coli (DAEC).
различаются по ключевым механизмам патогенеза и
наличию специфических факторов вирулентности,
делающих возможной их реализацию.

Выявление РНК и ДНК возбудителей ОКИ
в объектах окружающей среды и
клиническом материале методом ПЦР (Интерлабсервис)
Мульти-детекция:
АмплиСенс® Shigella Shigella и Shigella и EIEC/Salmonella /Campylobacter Shigella и EIEC/Salmonella /Campylobacter – 4/5
АмплиСенс® Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FL - ротавирусов группы А, норовирусов 2 генотипа - 3
АмплиСенс® ОКИ скрин ОКИ скрин ShigellaОКИ скрин Shigella и ОКИ скрин Shigella и EIEC,ОКИ скрин Shigella и EIEC, ОКИ скрин Shigella и EIEC, SalmonellaОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, ОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, CampyloОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-ОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, AdenovirusОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, ОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, RotavirusОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, Rotavirus,ОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, Rotavirus, NorovirusОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, Rotavirus, Norovirus, ОКИ скрин Shigella и EIEC, Salmonella, Campylo-bacter, Adenovirus, Rotavirus, Norovirus, Astrovirus - 8
Детекция отдельных возбудителей
АмплиСенс Rotavirus-Eph
АмплиСенс Norovirus 1,2 genotypes
АмплиСенс® Эшерихиозы-FL
АмплиСенс® Yersinia enterocolitica / pseudotuberculosis
АмплиСенс® Shigella spp. и EIEC-Eph
АмплиСенс Salmonella spp.-Eph
АмплиСенс Clostridium difficile-EPh

Структура эшерихиозов
Инфекционные болезни 2013; том 11; №3 (Горелов А.В., Бондарева А.В., Подколзин А.Т.
Инфекция и иммунитет, 2016; том 6; №3 (Соколова Е.Д., данные ДГБ №5,, 2012-2014;)
МОСКВА
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
n= 169

Проблема №2
Внедрение в работу лабораторий молекулярно-генетических методов для детекции «новых» важных бактериальных возбудителей ОКИ, способных к широкому эпидемическому распространению

MALDI TOF
Масс спектрометрия для идентификации и таксономии
E. coli (лак-) сложно дифференцировать от Shigella, так как они относятся к одному геновиду,
в комментариях предлагается поставить дополнительные фенотипические тесты

Проблема №3
Внедрение в работу лабораторий молекулярно-генетических методов :
для детекции факторов вирулентности диареегенных эшерихий
для определения серотипа т.н.
«Молекулярное серотипирование»

Использование
молекулярно-биологических методов - осознанная необходимость современной лабораторной диагностики острых кишечных инфекций

Серологические методы выявления Stx 1/2 (иммунохроматографические тесты)
RIDA®QUICK Verotoxin / O157 Combi test
Duopath®
Verotoxins
BioStar OIA SHIGATOX (США)
ImmunoCard STAT EHEC (США)

Вспышка E.coli O104:H4 в 2011 г.
С 8 мая по 17 июля 2011 г. (70 дней) в двух европейских странах (Германия и Франция) были зарегистрированы вспышки ОКИ с пищевым путем передачи, обусловленные
E.coli O104:H4 (E.coli O104:К9:H4)
Эпидемиологически обе вспышки были связаны с одним и тем же фактором передачи – пряно-ароматическим представителем семейства бобовых – «фенугреком (пожитником)»
(латинское название Trigonella foenum-graecum).

Вспышка E.coli O104:H4 в 2011 г.
Аналогичные случаи ОКИ, нередко с развитием ГУС, кроме Германии и Франции, также отмечены в 14 странах Европы и Северной Америки: Австрия (5 случаев), Великобритания (7), Греция (1), Дания (25), Испания (2), Чехия (1),Люксембург (2), Нидерланды (11), Норвегия (1), Польша (3), Швейцария (5), Швеция (53), а также Канада (1) и США (6).
Почти все заболевшие в мае-июне 2011 г. посещали северные районы Германии или имели контакты с лицами, вовлеченными в эту вспышку

E.Coli O104. Новая угроза
Май 2011,
Германия,
E.coli O104:H4
Фенугрик, пажитник

Фактор передачи:
пажитник, фенугрик
Является основной компонент смеси “карри”, входит в состав смесей «куркума», «хмели-сунели», «аджики», «кленового сиропа».
В США им ароматизируют ром и кленовый напиток, добавляют в тесто.
В Индии из обжаренных семян готовят суррогатный кофе.
Из молодых растений готовят салат.

Две группы имеют прямое отношение к ситуации, возникшей в Европе весной 2011 г.
Энтерогеморрагические E coli (EHEC),
Энтероаггрегативные E coli (EAgEC),
Его геном на 93 % идентичен геному штамма E.coli 55989, относящемуся к группе энтероаггрегативных эшерихий (EAEC), возбудителей диареи у человека, выделенному в Центральной африканской республике.

Гемолитико-уремических синдром (HYS)
Болезнь, представляющая угрозу для жизни.
Характерны симптомы:
Острая почечная недостаточность (уремия)
Лабораторно отмечается:
Гемолитическая анемия
Низкое число тромбоцитов (тромбоцитопения)
После ЭГКП-ОКИ –у 10% развивается ГУС; у 5% - летальность
ГУС может приводить к неврологическим осложнениям (судороги, инсульт, кома) - у 25% пациентов с ГУС

ВОЗМОЖНОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП ДИАРЕЕГЕННЫХ E.coli

Серотипы энтерогеморрагических E.coli – EHEC,
О1:Н-; O1:H20; O2:H-; О2:Н5; О2:Н7; O2:H29; O2:H39; O4:H-; О4:Н10; О5:Н-; О5:Н16; О6:Н1; O6:H3; O6:H34; O7:H4; O8:H19; O15:H-; O15:H27; O18:H-; O18:H7; O18:H11; O18:H?; O22:H8; O22:H16; O25:H-; O26:H-; O26:H11; O26:H32; O38:H21; O39:H4; O40:H8; O43:H2; O45:H2; O46:H31; O46:H38; O46:H?; O48:H21; O49:H-; O50:H7; O50:H-; O55:H7; O55:H10; O65:H16; O69:H11; O74:H?; O76:H19; O76:H25; O76:H?; O80:H-; O82:H8; O84:H2; O84:H-; O84:H?; O91:H-; O91:H10; O91:H14; O91:H21; O91:H7; O98:H25; O98:H-; O101:H19; O103:H2; O103:H?; O103:H-; O111:H2; O111:H8; O111:H11; O111:H30; O111:H34; O111:H-; O111:H?; 112ab:2; O113:H2; O113:H14; O113:H7; O113:H21; O113:H-; O114:H48; O115:H8; O115:H10; O115:H18; O116:H21; O116:H-; O117:H4; O118:H12; O118:H16; O118:H30; O118:H-; O121:H-; O121:H7; O121:H19; O125:H-; O125:H8; O126:H-; O126:H8; O128:H2; O128:H8; O128:H12; O128:H25; O128:H-; O157:H-; O157:H7; O163:H19; O165:H19; O165:H25; O165:H-; O126:H8; O128:H2; O128:H8;
Доступных отечественных Н-сывороток в РФ нет! Определяем только серогруппу

Esherichia coli O6
1. O6:K1
2. O6:K53:H1
3. O6:K2:H1
4. O6:K:H31
5. O6:K5:HNM
6. O6:K5:H1
7. O6:K13:H1
8. O6:K54:H10
9. O6:K15:H31
10. O6:K2:H7
11. O6:K:H10
12. O6:K:H34
13. O6:K:H49
14. O6:K15:H16 - ETEC
15. O6:K:H- - EHEC
16. O6:K:H1 - EHEC
17. O6:K:H4 - EHEC
Одна из наиболее гетерогенных групп по набору К и Н антигенов
(17 сероваров).
Из них к диареегенным относятся 4 (ETEC-1; EHEC-3) - красные;
3 серовара – комменсалы - синие;
10 сероваров –-уропатогенные

Распределение штаммов E.coli О6
по источникам выделения (2009-2012)

Энтероаггрегативные эшерии
Являются наименее изученными в мире
Впервые выделены в 1985 г.
Встречаются у больных ОКИ: 3,7-7,9%
Встречаются у здоровых: 5,6-11,8%
Отличаются способностью прикрепляться (адгезироваться) к эпителию кишечника и соединяться между собой, формируя биопленку
Вызывают заболевания у лиц с ослабленным иммунитетом

Клиника эшерихиоза, обусловленного EAgEC
Острое начало – 53,3%
Повышение температуры – 60%; гипертермия – 33,3%
Рвота – 66,6%
Патологический стул – у всех заболевших;
Частота - 4±0,5 раз/сутки; продолжительность – 2,8 ±0,7 дней
Патологические примеси: слизь - 46,7%; кровь - 2,6%
Гепато -и спленомегалия – 23%
Среднетяжелая форма – 66,7%; легкая – 33,3%
Протекал по типу
Гастроэнтерита - 40%; Энтерита – 40%; ГЭК - 20%
Осложнения со стороны МВП – 53,8%
Инфекционные болезни 2013; том 11; №3
Горелов А.В., Бондарева А.В., Подколзин А.Т.

Заключение
Комплексный подход с использованием
фенотипических и молекулярных методов может существенно повысить уровень достоверности идентификации возбудителей ОКИ и эффективность выявления резистентности к АМП

Автоматизированная система ADAGIO
Автоматизированная система ADAGIO – это считывающее устройство, позволяющее получать и обрабатывать изображение диффузии в чашке Петри при помощи прикладного програмного обеспечения для чтения антибиотикограмм

Эпидемиологический модуль
Статистический анализ всех сведений, имеющихся в базе данных
Широкие возможности эпидемиологического мониторинга
Гибкая система построения запросов
микробный пейзаж (стационар, отделения, тип пробы)
период времени (день, неделя, месяц, квартал, год)
мониторинг чувствительности к антибиотикам (R I S)
фенотипы резистентности (ESBL, MRS, VRE и др)

Вспышки брюшного тифа
1999 г. Волгодонск – сотни заболевших,
водный путь передачи
2005 г. Иркутск – меньше 20 («СДГН»)
Путь передачи водный (локальный);
2006 г. С-Пб, военное училище (более 300 чел)
Путь передачи - пищевой
2013 г. Пермь, рынок (трудовые мигранты)
Путь передачи – классический водный
2013 г. Московская обл. (общежитие »)
15 территорий: РФ (8), и страны НСГ
Путь передачи – пищевой + контактно - бытовой

S. enterica серовар S.Typhi
Сероводород ± «следы»
Мочевина -
Лизин +
Цитрат Симмонса –
Орнитин –
Индол –
Лактоза –
Глюкоза +, газ –

Стандартизация мутности суспензии
Денси-Ла-Метр
Назначение: прибор для определения мутности бактериальной суспензии
Принцип метода: измерение оптической доли поглощенного света
Стандартизация оптической плотности при проведении идентификации бактерий и определения чувствительности к антибиотикам – один из основных критериев успешного проведения данных тестов.

Проблема №5
Отсутствие национальных референс лабораторий по детекции механизмов резистентности у клинически значимых штаммов микроорганизмов.

Проблема №6
Резистентность к антибиотикам
Методы определения
Оборудование для определения
Критерии оценки (S, I, R)