ДНК диагностика фитопатогенов

Методы диагностики
Визуальный
Индикаторные растения
Электронная микроскопия
Серологическая диагностика
ДНК диагностика

ДНК диагностика
Полимеразная цепная реакция – ПЦР
Традиционная ПЦР
ПЦР в реальном времени
Детекция после ПЦР (end-point detection)
Биочипы

ДНК диагностика
Сбор материала
Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК, РНК)
Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Регистрация сигнала
Обработка результатов

Полимеразная цепная реакция – ПЦР
После проведения реакции из одной молекулы ДНК образуется миллионы идентичных копий

ДНК диагностика
Диагностика урогенитальных инфекций (хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, кандидоз и др.).
Вирусные заболевания (гепатиты В и С, вирус папилломы человека, ВИЧ).
Детекция микобактерий туберкулеза.
Изучение экспрессии генов в различных тканях
Анализ SNPs.
Детекция трансгенов.
Применение в селекции растений.
Детекция фитопатогенов.

Детекция фитопатогенов
Контроль безвирусного посадочного материала
Детекция вироидов
Детекция фитоплазм
Детекция вирусов в насекомых-переносчиках

Используется с 1995 г.

Диагностика должна быть:
Быстрой
Дешевой
Точной
Чувствительной
Широко применимой
Воспроизводимой

Подходы к диагностике
Одновременный анализ большого количества образцов на один фитопатоген
Анализ в одном образце большого числа фитопатогенов

Традиционная ПЦР
Быстрота анализа.
Высокая точность.
Воспроизводимость.
Простота, легкость в применении.

Недостатки традиционной ПЦР
Длительность.
Высокий риск контаминации.
Высокие затраты при массовых анализах.
Ядовитые реагенты (EtBr).
ТРУДОЕМКОСТЬ

Молекулярные беконы – структура шпильки.
TaqMan-зонды – линейные зонды (Roche Diagnostics).
«Скорпион»-зонды – структура шпильки и билинейная (Invitrogen).
ПЦР в реальном времени

Молекулярный бекон (Molecular Beacon).

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БЕКОНЫ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БЕКОНЫ

TaqMan-зонд - в процессе проведения ПЦР происходит освобождение флуоресцентной метки
ДНК-зонд гибридизуется с амплифицируемой последовательностью
ДНК-зонд в процессе амплификации разрушается ДНК-полимеразой и метка начинает флуоресцировать

«СКОРПИОН»-ЗОНДЫ

Сравнение технологий

Используя разные флуоресцентные метки можно детектировать в пробирке разные ПЦР продукты

Детекция флюоресценции
Детекция в режиме
реального времени
(Real-time PCR)
Детекция после ПЦР
(end-point detection)

Детекция флюоресценции
Real-time PCR
End-point detection

Преимущества ПЦР в реальном времени:
- все операции проводятся в одной пробирке;
- исключается риск контаминации ПЦР-смеси и продуктов;
- быстрота анализа;
- возможность автоматизации;
- экономия затрат времени и труда.

Преимущества ПЦР в реальном времени:
Чувствительность
В 10000 раз более чувствительнее чем ELISA
В 100 раз более чувствительнее чем обычный ПЦР

Детекция вироида веретеновидности клубней картофеля PSTVd

Детекция вироида веретеновидности
клубней картофеля PSTVd
кДНК
РНК
ОТ-ПЦР
Real-time PCR
или
End-point detection

Детекция картофельного вироида PSTVd

Детекция картофельного вироида PSTVd

Детекция картофельного вироида PSTVd

Детекция вирусов X и Y картофеля
Детекция вируса Y
Детекция вируса Х

Детекция вирусов картофеля
Сокращение времени детекции
в 2 раза
Детекция вируса Х картофеля с помощью Real-time ПЦР

Диагностикумы
Картофель: Вирусы Х и Y, вирус скручивания листьев картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля
Земляника: вирус кольцевого пожелтения жилок листа, вирус крапчатости листьев, вирус слабого краевого пожелтения листа, вирус морщинистости листьев земляники, микоплазмы;
Огурец: Вирус огуречной мозаики, вирус зеленой крапчатой мозаики.

Возможность использования в полевых условиях

Возможность использования в полевых условиях
Экстракция ДНК
ПЦР

Биочипы
Возможность одновременно детекции более 30000 мишеней