Инновационный подход к получению Wnt-лигандов.

Цель
Создание технологии снижающей стоимость производства Wnt3а-лиганда.

Введение
Белки семейства Wnt являются лигандами Wnt/Frizzled сигнального каскада.
Наиболее изученным из них является Wnt3a-лиганд.

Wnt3а
Wnt3а-лиганд- фактор роста, участвующий в клеточной пролиферации и дифференциации. Он применяется в регенерационной медицине и как агент для выращивания стволовых клеток.
В ходе экспериментов нашей лаборатории было предположено и доказано, что белок Р0 стимулирует выработку Wnt3а-лиганда.

Технология культивирования стволовых клеток на фидерном слое из мышиных фибробластов не позволяет вследствие иммунных реакций использовать клетки для введения в организм больного человека.
Бесфидерное культивирование стволовых клеток позволяет избежать многих негативных эффектов. Необходимым компонентом данной технологии является Wnt3а-лиганд.
Стволовые клетки человека растущие на фидерном слое фибробластов мыши.

Трудности получения.
Wnt-лиганды гидрофобны и плохо растворимы. Их получение с помощью бактериальных клеток невозможно вследствие сложных путей секреции и модификаций (липидных и углеводных).
Эукариотические клетки выделяют Wnt-лиганды в очень малых количествах, в результате чего их получение чрезвычайно дорого.

Почему оптимизация производства Wnt-лигандов актуальна?
Цена из каталога R&D Systems

На сегодня в России :
Лицензии Росздравнадзора на осуществление забора и хранения клеточного материала (Банк стволовых клеток) имеют 10 учреждений:
1. ОАО "Институт Стволовых Клеток Человека" (Гемабанк)- Москва
2. ООО "Флора-мед" - Москва
3. ООО "Желдормфармтранс" (ассоциация "Мера-Мед") - Москва
4. ГУЗ Москвы "Банк стволовых клеток департамента здравоохранения
г. Москвы"
5. ГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН - Москва
6. ООО "Криоцентр" - Москва
7. ГУП "Поволжский банк гемопоэтических клеток" - Самара
8. ЗАО "РеМеТэкс" - Москва
9. ООО "Бьюти Плаза" - Москва
10. ООО "Транс-Технологии" Санкт-Петербург.
Enamine, Ltd – Киев, Украина
Список опубликован во 2 номере журнала "Клеточная трансплантология и тканевая инженерия"

Разработка
Создание клеточной культуры с повышенной экспрессией гена P0 для получения Wnt3а-лиганда с меньшими финансовыми затратами.
Клетки мышиных фибробластов линии L.
Система была проверена на клетках мышиных фибробластов линии L.
Получены предварительные результаты.

Методика
Клетки экспрессирующие Wnt3а
Клетки гиперэкспрессирующие Wnt3а и Р0
Перенос среды содержащей Wnt3а
Выращивание клеток, интенсивность флуоресценции которых связана с содержание Wnt3а в среде.
Измерение флуоресценции клеток

Содержание Wnt3а в среде.
маркер
День3
Wnt3a+P0
День3
Wnt3a
День3
L-клетки
День2
Wnt3a+P0
День2
Wnt3a+P0
День2
L-клетки
День1
Wnt3a+P0
День1
Wnt3a
День1
L-клетки
L-клетки- контроль.
Wnt3a-клетки, гиперэкспрессирующие дополнительный ген Wnt3a.
Wnt3a+P0-клетки гиперэкспрессирующие дополнительный гены Wnt3a и P0.

Интенсивность флуоресценции клеток.
(активность Wnt3a)
Стимуляция средой, полученной от клеток гиперэкспрессирующих Wnt3a+P0
Стимуляция средой, полученной от клеток гиперэкспрессирующих Wnt3a

Сравнительная активность флуоресценции репортетных TOPdGFP-L клеток при стимуляции их средой.
L-TOPdGFP
+ P0 Wnt3a medium
+ Wnt3a medium

Перспективы
Достичь большей экспрессии P0, и как следствие добиться повышения производства и активности Wnt3a-лиганда;
Оптимизировать методы выделения и очистки
Wnt3а-лиганда.
3) Масштабировать все процессы.