Сeквенирование нуклеиновых кислот

Метод блуждающего пятна или «Сенгерпринт»
Пометить олигонуклеотид по 5’- или 3’- концу.
Частичный гидролиз олигонуклеотида соответствующими экзонуклеазами.
Электрофорез на ацетате целлюлозы при рН 3,5
Гомохроматографию на DEAE-целлюлозе.
Радиоавтография полученной хроматограммы
Расшифровка результатов

Электрофорез на ацетате целлюлозы
в аммоний ацетатном буфере при рН 3,5
-
+
DEAE-целлюлоза

Гомохроматография на DEAE-целлюлозе
-A
-T
-G
-A
-C
-T
-T
-C
-T
-A
p*NATCTTCAGTA
-C
-A
-G
-T
Частичный гидролизат tРНК

рК оснований
6.4
1.0
9.5 (N-3)
5’-UMP
6.3
0.8
4.5 (N-3)
5’-CMP
6.1
0.7
9.4 (N-1)
2.4 (N-7)
5’-GMP
6.1
0.9
3.8 (N-1)
5’-AMP
рК2 фосфата
pK1 фосфата
рКа оснований-N
Нуклеотиды

Протонирование оснований при рН 3,5

Общий заряд олигонуклеотида рGATCTTCAGTA и его фрагментов

Определение последовательности нуклеиновых кислот методом
Максама - Гилберта
Пометить фрагмент ДНК (РНК) с 5’- или 3’- конца
Провести 4 химические реакции для отщепления оснований от цепи НК
Расщепить сахарофосфатный остов в местах где отсутствуют основания
Гель-электрофорез в ПААГ
Радиоавтография
Расшифровка результатов

Отщепление пуриновых оснований под действием 60% HCOOH

Отщепление гуанина под действием Me2SO4

Отщепление тимина под действием гидразина

Отщепление цитозина под действием гидразина в присутствии 2М NaCl

Общая схема проведения секвенирования по Максаму - Гилберту
Т4-полинуклеотидкиназа, γ-АТФ
Рестриктаза EcoR I
Разделение фрагментов
5’ – GATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA - 3’
3’ – CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCT - 5’
5’-*pGATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCTp*-5’
5’-*pGATCGCTATACGAG AATTCAGCTCGA - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA GTCGAGCTp*-5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’- AATTCAGCTCGA - 3’
3’ - GTCGAGCTp*-5’
5’-*pGATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCTp*-5’

5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
Me2SO4
H+
NH2-NH2
NH2-NH2 +NaCl
Химическая модификация
по Максаму-Гилберту
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTA A -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’

G
A+G
T+C
C
*pGATCGCTATACGA
*pGATCGCTATAC
*pGATC
*p
*pGATCGCTATACGA
*pGATCGCTATACG
*pGATCGCTATAC
*pGATCGCTAT
*pGATCGCT
*pGATC
*pG
*p
*pGATCGCTATA
*pGATCGCTA
*pGATCGC
*pGATCG
*pGAT
*pGA
*pGATCGCTATA
*pGATCG
*pGAT
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’