Болезнь Гантингтона

Методы лечения БГ
Антисмысловые РНК
2. Редактирование ДНК
Мегануклеазы на основе цинковых пальцев
CRISPR / Cas9 мегануклеазы
3. Применение ИПСК без редактирования мутации
4. Ингибирование пролилолигопептидазы.
(снижает агрегацию PolyQ и улучшает жизнеспособность клеток в клеточной модели болезни Хантингтона)

Антисмысловые РНК

ИПСК без редактирования
1) Биопсия соматических клеток (фибробластов)
2) Получение ИПСК
3) дифференцировка клеток в нужном направлении
4) прямая инъекция клеток в Полосатое тело
Плюс:
+ Не надо редактировать геном (немного ниже риск образования опухоли)
Минус:
- Повторные инъекции при появлении симптомов

Редактирование ДНК
С помощью ИПСК
Использование мегануклеаз на основе CRISPR / Cas9 они НЕспецифично режут ДНК, создать ЛЕГЧЕ.
1) Биопсия соматических клеток (фибробласты)
2) Репрограммирование в ИПСК
3) Редактирование мутации
4) Отбор клеток
5) Дифференцировка клеток в нужном направлении
6) Прямая инъекция в Полосатое тело
Гомологичная Исправление
Рекомбинация мутации
Вирусный вектор напрямую в организм in vivo
Использование мегануклеаз на основе цинковых пальцев, т.к. они специфично режут ДНК, но их сложнее создать
1) Создание вируса
2) Прямая инъекция вируса в Полосатое тело
Нокдаун Гена Нет белка

Использование ИПСК в качестве лечения БГ

Репрограммирование Соматических клеток в ИПСК
Краткая схема репрограммирования соматических клеток (фибробластов) в индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК).
1. Интегрирующий метод состоит в использовании вирусного вектора на основе ретровируса.
2. Не интегрирующие методы включают в себя использование: вирусного вектора, на основе Сендай вируса (SeV), эписомальных плазмид (Epi), а также РНК (miRNA и mRNA).

Фибробласты
ИПСК

CRISPR/Cas9

Дизайн sgRNA и полученные плазмиды
РАМ последовательность для Cas9
Последовательность sgRNA
Мутация
ДЛЯ БГ
T1: GGCCTTCATCAGCTTTTCCAggg,
T2: GGAAGGACTTGAGGGACTCGAagg,
T3: GGCTGAGGAAGCTGAGGAGGcgg,
T4: GCCCCCGCCGCCACCCGGCCcgg
and control gRNA: ACCGGAAGAGCGACCTCTTCT (PAM sequence are shown in lowercase).

ssODN-#1
ssODN-#2
ssODN-#3
ssODN-sa
Дизайн ssODN

eSpCas9(1.1)-sg#1 (ПЛ – 9%, ГЛ – 1,4%)
eSpCas9(1.1)-sg#2 (ПЛ – 9,6%, ГЛ – 3,2%)
eSpCas9(1.1)-sg#3 (ПЛ – 9%, ГЛ – 8,1%)
SpCas9(HF4)-sg#1 (ПЛ – 9,4%, ГЛ – 1,5%)
saCas9-sa_sg#3 (ПЛ – 9,4%, ГЛ – 7,2%)
Результаты
ПЛ- Плазмидный Локус ГЛ- Геномный Локус

Частота Инделов и Гомологичной Рекомбинации (ГР)
Наиболее эффективная комбинация –
saCas9-sa_sgCFTR#3 и ssODN-saCFTR
инделы – 7,2% (0,6%-22,5%)
ГР – 19% (17%-21,7%)
Остальные варианты редактирования:
инделы – от 1,2% до 3,2%
ГР – от 0% до 0,5%

Роль Астроцитов в БГ
Cтало ясно, что другие типы клеток, включая астроциты, играют важную роль в патогенезе HD. Мутантный белок HTT (mHTT) присутствует в нейрональных и ненейронных клеточных типах всей нервной системы.

Генетическая нестабильность ИПСК
В настоящие время одной из главных проблем применения ИПСК в качестве клеточной терапии является их генетическая нестабильность (образование мутаций в ходе репрограммирования и культивирования), которая может привести к образованию злокачественных опухолей и появляется из-за:
1) Ранее существовавших вариации в родительских соматических клетках, которые могут проявляться в процессе образования ИПСК
2) Мутации, вызванных репрограммированием и которые происходят в процессе репрограммирования.
3) Индуцированные пассажем мутации, возникающие при длительном культивировании.
Поэтому все исследования связанные с ИПСК проводят либо на клеточных культурах, либо на животных (доклинические исследования).
НЕТ НИ ОДНОГО КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.